13份化橘红种质的鉴定研究

叶宾　黄洁文　李 宇　魏鸿瑶　吴良肪　丁 玙　谷潇雨　赵杰堂　胡桂兵　秦永华　王艳慧　张志珂

关键词：化橘红；种质鉴定；植物学性状；化学成分；分子标记

中图分类号：S666.3 文献标识码：A

化橘红为芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）化州柚（Citrus grandis ‘Tomentosa）或柚[Citrusgrandis （L.） Osbeck]的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，通过清洗、杀青、烘干、修剪、陈放后得到。化橘红是一种广东省的道地药材，一般产自广东省化州市，因其含有丰富的二氢黄酮、野漆树苷、柚皮苷等成分，具有散寒燥湿、利气消疾、止咳化痰及健脾消食等功效，素有“南方人参”的美誉，随着产业的扩张，化橘红在市场上出现的问题也日益明显，以假充真、以次充好或产品标识不全的现象充斥在化橘红交易市场中。

以化州当地果农的习惯，根据果实表面绒毛多少，可将化橘红品系分为6 类：正毛、黄龙正毛、密叶正毛、副毛、假西洋、光青[1]。正毛化橘红与非正毛化橘红的种苗在外观形态上非常相似，运用传统的形态学方法很难加以区分。有研究证明毛橘红的药用价值更高[2]，其售价也会更高，由于市场的不规范导致利用光橘红冒充毛橘红的现象出现。因此，如何对不同种质的化橘红进行辨别和分类，对于农户和市场来说都是一个亟需解决的问题[3]。

能否通过多种手段对化州当地不同产区的正毛化橘红和非正毛化橘红进行鉴定和区分，相关文献中大多采用一种方法（如分子标记或形态学分析）进行鉴定。因此，本研究通过植物性状观察、结合化学分析成分以及利用分子标记技术对化州不同产地的13 份化橘红材料进行种质鉴别，为更好地对不同种类的化橘红进行有效辨别和鉴定提供参考。

1 材料與方法

1.1 材料

以化州当地传统分类的正毛化橘红（大合黄绒、大合密叶、平定黄绒、平定密叶、平定红肉、山车正毛、带刺正毛）和非正毛化橘红（山车凤尾、山车副毛、山车假西洋、山车光青、平定金钱笃、平定实生梨）共13 份化橘红种质作为供试材料，每种化橘红共收集健康且生长状况相近的花30 朵、叶15 片及大小相近的果实10 个用作植物学性状特征的测定和分析，其中叶片采自树体上方每个春梢的前1～5 片新叶，花主要采自树体上方每个春梢的前1～10 朵花，果实主要采自树体下方生长较密集的区域；以其果实干品为材料进行药用成分的提取；以叶片作为材料提取DNA，以供后续分子标记实验使用。

1.2 方法

1.2.1 化橘红种质植物学特征性状的测定 本研究对化橘红种质植物学特征的测定主要参照柑橘种质资源描述规范（NY/T 2930—2016），对叶片进行叶形、叶长、叶宽、叶型指数、叶缘形状、翼叶长、翼叶宽、叶尖形状、翼叶形状、叶基形状和L*、a*、b*等植物学特征性状进行测定。以叶型指数=叶长/叶宽的计算公式对叶型指数进行计算；用色差仪测定每片叶片的颜色；肉眼观察叶缘形状、叶基形状等其他植物学性状并记录；每个种质随机取其中2 片叶片，拍摄其正反面。对化橘红种质的花瓣颜色、花瓣数量、花瓣长度、花瓣宽度、花形指数、花粉数量、花柱及雄蕊数这8 项植物学特征性状进行测定和数据记录。花型指数=花瓣长/花瓣宽；每个种质随机取出其中2朵花，拍摄其正侧面。对化橘红种质的单果重、果面颜色、中果皮颜色、果实纵横径、果型指数、果基形状、有无果颈、果基凹陷、果顶形状、果顶印圈等植物学特征性状进行测定和数据记录；每个种质取出其中3 个果实，拍摄其正面、侧面、背面、横切面和纵切面的照片。

1.2.2 化橘红种质的化学成分检测分析 本研究主要对化橘红化学成分中的总黄酮（柚皮苷）、野漆树苷、水溶性浸出物（包含多糖物质、水溶果胶、水溶性维生素、水溶蛋白和无机盐等）和醇溶性浸出物（包括皂苷类成分等）4 项指标进行提取和检测，每种指标测定重复5 次。

依据《地理标志保护产品 化橘红》[4]所提供的方法，测定化橘红种质的总黄酮（柚皮苷）含量；依据《中华人民共和国药典》2015 年版[5]，利用HPLC 测定化橘红种质的野漆树苷含量；参照《中华人民共和国药典四部 2020》[6]的方法，测定水溶性浸出物和醇溶性浸出物。

1.2.3 分子标记鉴定化橘红种质 采用CTAB 法提取叶片DNA，参照张静芳等[7]的方法，确定用于ISSR 的单引物共14 个（表1）和SRAP 的引物共20 对（表2）。

参照赵依杰等[8]的方法确定ISSR 的反应体系，PCR 扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，根据不同的引物调整最适退火温度，退火1 min，72℃延伸1 min，35 个循环；72℃延伸10 min。参照燕佳文等[9]的方法确定SRAP 的总反应体系，PCR 扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，根据不同的引物调整最适的退火温度，退火1 min，72℃延伸1 min，共5 个循环；紧接以上反应条件后94℃变性1 min，最适温度下退火1 min，72℃下延伸1 min，35 个循环；72℃延伸10 min。PCR 产物均由2%的琼脂糖凝胶检测，130 V 下电泳60 min，所得产物于凝胶成像系统下观察。

1.3 数据处理

采用SPSS 23.0 软件对所测定每份种质的叶、花、果等数量性状进行平均值和标准差的计算，并以平均值±标准差的形式表示各项数据；计算每份种质中各项化学成分指标的平均值和标准差。根据Neis 遗传一致度，采用SPSS 23.0 软件将化学成分含量的测定结果结合性状的测定结果利用非加权配对算数平均法（unweighted pair groupmethod using arithmetic average，UPGMA）对其进行相关性聚类分析。利用Popgen 32 软件对ISSR 和SRAP 条带进行观察和记录，无特异性条带的地方记为“0”，有则记为“1”，采用SPSS 23.0 软件根据Neis 遗传一致度，用UPGMA 将ISSR 和SRAP 分子标记结果进行整合，对13 份化橘红种质进行遗传聚类分析。

2 结果与分析

2.1 植物学特征性状数据的整理和分析

13份化橘红种质的性状测定结果见表3。13份种质在叶缘形状、翼叶形状和叶基形状上无显著差异；大部分正毛种质的叶显著比非正毛更长；正毛的叶宽与非正毛的无显著差异；叶型指数上，若以1.90 为阈值，非正毛种质中山车凤尾、山车假西洋、山车光青、山车副毛、平定金钱笃和实生梨形皆小于1.90，正毛中除平定红肉和带刺正毛外皆大于1.90，说明大部分正毛种质的叶要比非正毛更细长；在色差测定中，若以L*值42.00为阈值，所有非正毛种质均小于42.00，正毛中仅有平定红肉和带刺正毛小于42.00，说明正毛种质的叶总体上比非正毛更偏白；从所测a*值可知所有非正毛种质（山车凤尾、山车假西洋、山车光青、山车副毛、平定金钱笃、实生梨形）均大于–17.00，正毛种质除平定红肉和带刺正毛外均小于–17.00，说明大部分正毛种质的叶比非正毛更偏绿；从所测b*值可知所有非正毛种质（山车凤尾、山车假西洋、山车光青、山车副毛、平定金钱笃、实生梨形）均小于25.00，正毛种质除平定红肉和带刺正毛外均大于25.00，说明大部分正毛种质的叶比非正毛更偏黄。

花的性状测定结果见表4，在花瓣数量、花瓣颜色和花柱状况上这13 份种质无显著差异；在花瓣长度上，非正毛种质山车凤尾、山车光青、山车副毛、平定金钱笃和实生梨形的均值均在23.00 mm 以下，而正毛种质除平定黄绒、大合黄绒和大合密叶外，剩余均在23.00 mm 以上，最大的是平定密叶，均值为36.77 mm；在花瓣宽度上，非正毛种质山车凤尾、山车光青、山车副毛和实生梨形的均值均小于9.50 mm，仅有平定金钱笃大于9.50 mm，为9.67 mm，而在正毛种质中有平定黄绒、平定密叶、大合黄绒和大合密叶4 份种质大于9.50 mm，剩余正毛种质的花瓣宽度均大于9.50 mm，最大的是带刺正毛，均值为10.91 mm；在花粉数量上，山车凤尾、山车假西洋和平定金钱笃的花粉数量测定为中或少，3 份均为非正毛种质；在雄蕊数上，两类种质无显著差异。

果实性状测定结果见表5。13 份化橘红种质在放射沟纹、果顶印圈、果顶凸环、果皮颜色、果心充实度和中果皮颜色这6 个性状中无显著差异；在果形上，正毛和非正毛种质有显著差异，其中山车假西洋、山车光青、山车副毛、平定金钱笃和实生梨形等非正毛种质中果形指数大于0.95，多呈球形或梨形，而正毛种质果实果型指数小于0.95，整体呈高扁圆形，差异显著；在果顶形状上，非正毛种质多呈平滑状，正毛种质多浅凹；在果基形状上，2 类种质无显著差异。以平均果型指数0.95 作为分界时，可见非正毛种质山车凤尾、山车假西洋、山车光青、山车副毛和实生梨形的果型指数均大于0.95，仅有平定金钱笃小于0.95；正毛种质中有山车正毛和大合密叶果型指数大于0.95，剩余正毛种质中平定黄绒和平定红肉的果形指数分别为0.81 和0.89，小于0.90，和非正毛种质差异较大。从果实横纵径也可看出，正毛种质的果实形状相比非正毛种质更趋向于扁圆，而非正毛种质果实更趋向于球形。

2.2 化橘红种质干品的化学成分

化橘红种质的化学成分检测结果见表6。在13 份化橘红样品中，绝大多数正毛种质的野漆树苷平均含量高于5.00 mg/g，平均含量最高的种质为大合黄绒和山车正毛，分别达到了11.80 mg/g和11.59 mg/g ； 6 份非正毛样品除山车副毛（5.01 mg/g），其他种质的野漆树苷平均含量均低于5.00 mg/g，尤其是山车假西洋和平定实生梨形，含量低于1.00 mg/g，非正毛种质的野树漆苷含量与正毛有显著差异，可以一定程度上区分出正毛和非正毛化橘红。

13份材料中有8 份化橘红样品（其中包括3份正毛和5 份非正毛材料）的柚皮苷平均含量高于80.00 mg/g ， 平均含量最高为平定金钱笃（124.53 mg/g），非正毛的山车光青和山车副毛柚皮苷平均含量分别为117.57 mg/g 和106.35 mg/g，剩余5 份材料的柚皮苷含量均低于80.00 mg/g，其中最低为山车凤尾（25.30 mg/g），另外4 份为正毛化橘红；待测种质中正毛和非正毛化橘红中均存在柚皮苷含量相对较高且含量接近的种质，因此不能完全将正毛种质和非正毛种质区分开来；平定黄绒种质柚皮苷含量要低于大合黄绒，而大合密叶则比平定密叶要低，说明不同的产区或地理条件也可能影响化橘红种质的柚皮苷含量。

正毛与非正毛种质在醇溶性浸出物中有显著性差异，在水溶性浸出物中无显著差异。13份化橘红种质的醇溶性浸出物含量为25%～39%，其中含量最低的为山车正毛（25.83%），含量最高的为山车凤尾（38.65%）；在正毛化橘红种质中，醇溶性浸出物的含量为25%～35%，部分种质的浸出物含量低于30%，而在非正毛化橘红种质中，醇溶性浸出物为35%～39%，除平定金钱笃（34.33%）和石湾实生带刺（36.50%）以外，相比于大多数正毛化橘紅种质，非正毛种质（山车正毛、山车光青、山车假西洋和山车凤尾）的含量相对更高；水溶性浸出物含量为33%～42%，含量最低的是山车正毛，为32.91%；含量最高的是山车假西洋，为41.82%；在正毛化橘红中，水溶性浸出物的含量为33%～42%，而非正毛种质则为36%～42%，相对于部分正毛化橘红，其水溶性浸出物含量更高， 但与平定密叶（ 36.75% ）、平定金钱笃（39.42%）、大合密叶（39.56%）等种质相比，其水溶性浸出物的含量差异并不大。

2.3 植物学性状与化学成分结果的聚类分析聚类分析

结果见图1，以遗传距离为10 cM作为分界时，可将13 份化橘红种质聚为4 类，其中平定黄绒、平定密叶、大合密叶、山车正毛、山车副毛、山车凤尾、平定金钱笃、平定红肉、平定实生梨以及山车光青10 份种质聚为第1 类，山车假西洋、大合黄绒和石湾带刺正毛分别单独聚为第2、第3 和第4 类。在第1 类聚类结果中既存在正毛化橘红（平定黄绒、平定密叶等），也存在非正毛化橘红（山车副毛、山车凤尾等），因此仅依靠植物学性状和化学成分无法区分13 份种质中的正毛和非正毛化橘红。

2.4 化橘红种质的分子标记

2.4.1 ISSR 分子标记鉴定化橘红种质 ISSR 扩增结果见表7。所有引物扩增共获得103 条扩增条带，其中多态性条带共有77 条，平均多态位点百分率为74.8%；引物扩增出的条带数为5～10 条，平均7.4 条；多态性条带数为3～8 条，平均5.5条；部分引物扩增结果见图2，扩增条带数最多的为引物Z809，共扩增出10 条条带，其中多态性8 条，多态率为80%（图2）。

2.4.2 SRAP 分子标记鉴定化橘红种质 SRAP扩增结果见表8，所有引物扩增共获得76 条扩增条带，其中多态性条带共有72 条，平均多态位点百分率为94.7%；引物扩增条带为1～8 条，平均3.8 条；多态性条带数为1～8 条，平均3.6 条，多态性相对ISSR 较低；部分扩增结果见图3。

2.5 13 份化橘红种质的ISSR 和SRAP 分子标记结果的聚类分析

13份化橘红种质的聚类分析结果见图4，当遗传距离为15 cM 时，可将13 份化橘红分为4类。其中大合密叶、平定黄绒、大合黄绒、山车正毛、平定红肉、带刺正毛、山车假西洋和平定密叶共8 份种质聚为第1 类，山车副毛和山车光青2 份种质聚为第2 类，山车凤尾和平定金钱笃2 份种质聚为第3 类，实生梨形单独聚为第4 类。

从聚类分析结果看，第1类中的8份种质除山车假西洋外均为正毛化橘红，在果实绒毛、果实形状等性状上均较为相似，而第2、第3 和第4 类共5 份种质均为非正毛化橘红，与第1 类中的种质在叶长、叶型指数、色差值、花瓣长、果实形状和有无茸毛等性状上差异显著。由此可见，ISSR和SRAP 分子标记能较好地区分正毛和非正毛化橘红种质。

2.6 13份化橘红种质植物学性状与化学成分含量的相关性分析

13份化橘红种质植物学性状测定及化学成分含量相关性分析结果见表9，化橘红果实的野漆树苷含量与花瓣数量、果实横径呈显著正相关（P<0.05），水溶性浸出物与L*值呈显著正相关；野漆树苷含量与果型指数呈极显著负相关（P<0.01），从该结果推测化橘红的植物学性状中仅有果型指数和果实形状与化学成分含量相关性较大，果型指数对有效成分的含量影响更大；其他植物学性状与化学成分含量间无显著相关。

3 讨论

3.1 关于化橘红植物学性状对种质鉴别的影响

许多植物学性状可对化橘红的种质鉴别产生影响，缺少相关的性状数据会导致化橘红资源管理的欠缺，阻碍化橘红的生产与发展[10]。通过肉眼观察部分性状能直观地区分正毛和非正毛化橘红，如正毛和非正毛种质的叶型指数有显著差异；其次，相对于正毛种质的叶尖而言，部分非正毛种质（光青、副毛）的叶尖更钝；还可直接观察果实形状和果面上的茸毛量等。若借助实验仪器（游标卡尺、色差仪、电子天秤等）进行其他性状（如叶型指数、花型指数、果型指数和单果重等）进行测定，便能对化橘红种质作更进一步的鉴别。在13 份化橘红种质中，无论叶、花还是果实在正毛和非正毛种质中均存在差异显著的性状，这与曹征等[11]的研究结果一致，测定植物学性状是化橘红种质鉴别的有效手段之一。

3.2 化橘红种质化学成分含量差异的原因及其在种质鉴别上的应用

不同产地及品种的化橘红种质，其内在所含的化学成分的含量也会存在差异[12]；通常来说，相同条件下毛橘红化学成分含量要比光橘红高。因此，针对来自不同产地的13 份化橘红种质可通过测定果实干品化学成分含量，对其进行质量检测分析，通过化学成分的含量差异对这些种质进行区分和鉴定。作为一款应用历史悠久的传统中药材，对于化橘红各种化学成分的研究也有不少报道，方法也在不断地创新，发挥药用作用的如柚皮苷[13]、野漆树苷等[14]，其提取和测定的效率对于化橘红作为中药材在市场上的应用有着十分重要的意义。本研究发现在这13 份种质中，正毛和非正毛化橘红的化学成分含量不同，尤其是野漆树苷和醇浸出物的含量有显著差异，推测这2个成分可作为种质鉴别的参考依据之一；不同产地可能会对相同种质的药效产生一定影响，由于化州市各乡镇产区在地形、生态和土壤环境等存在较大差异[15]，推测可能是气候、土壤等环境因素或管理水平等会影响种质的化学成分。本研究中正毛和非正毛种质在柚皮苷和水溶性浸出物上无显著差异，部分正毛种质还出现了柚皮苷含量相对较低的情况，同样也可能是受环境因素影响，也可能是加工和保存过程中造成部分正毛种质果实的化学成分含量发生变化[16]；相反，平定金钱笃和山车光青等一些非正毛化橘红也有着相对较高的柚皮苷含量，因此也具有良好的药用功效。从研究结果推论，以醇溶性浸出物含量作为标准对正毛和非正毛化橘红进行区分和鉴定的效果优于水溶性浸出物，可以用作区分正毛化橘红和非正毛化橘红的手段和参考依据之一；水溶性浸出物一般包含各种游离氨基酸、核苷酸和糖原、糖类等物质，而醇溶性浸出物包含皂苷物质和其他各种有机物质等，均是人体所需的一部分营养物质，对于研究化橘红的药用功效有着重要意义。通过化学成分结果可以看出从野漆树苷和醇溶性浸出物含量，对于13 份化橘红种质的鉴别和区分都有着良好的效果，说明利用化学成分也可在一定程度上鉴别和区分不同类别化橘红种质。

因此在实际的化橘红种植和生产中，选择种植品种时要充分考虑当地的环境条件[17]，最大程度增加橘红果实的药用价值，也可适当种植部分化学成分较高的非正毛种质，增加当地橘红的多样性，有利于化橘红种植产业的蓬勃发展。总的来说，对化橘红的化学成分测定和分析都是十分重要且对橘红产业发展意义重大的一项工作。

3.3 ISSR 与SRAP 分子标记对于化橘红种质鉴别效果的比较

ISSR 和SRAP 两种分子标记能成功地将13 份化橘红种质中的正毛与非正毛种质从一定程度上区分开来，与前人用ISSR 实验的鉴定结果吻合[3]。SRAP 的条带数量和多态性条带数量都比ISSR少，可能是SRAP 的引物组合可能对于外界温度的变化较ISSR 的敏感，在一定程度上影響了SRAP 的结果；从聚类结果可知，2 种分子标记综合聚类下可将13 份化橘红种质区分为正毛和非正毛两大类，鉴定效果较好。

ISSR 和SRAP 分子标记能很好地应用于化橘红的种质鉴别，2 种分子标记方法各有优劣，而相比于ISSR 分子标记，SRAP 分子标记在引物组合选择上更为灵活，正向引物可与反向引物两两组合，使用效率更高[18]。因此，在实际操作中，应当依据不同分子标记的特点和注意事项，力求得到更好的实验结果。

3.4 13 份化橘红种质植物学性状、化学成分与分子标记结果的相关性分析

化橘红果实的形状与其所含的化学成分有较大的关系，更趋向于扁圆形的果实的化学成分含量越高，而正毛化橘红果实的形状趋向于高扁圆形，而非正毛化橘红果实更趋向于梨形或球形。化州柚的化学成分含量要显著高于光青柚和其他柚，一定程度上也说明正毛的化学成分要高于非正毛种质，与前人研究结果[19]一致。曹征等[11]通过聚类分析将正毛橘红归为第1 类，光橘红归为第2 类，且第2 类化橘红种质资源的化学成分含量更高。水溶性浸出物含量与L*值呈显著正相关，叶片的L*值越高，其水溶性浸出物含量（如游离氨基酸等各类含氮营养物质）可能也越高。2种分子标记都可将13 份种质以平定假西洋为界分为正毛和非正毛种质，二者在部分植物学性状上存在显著差异，如叶长、叶型指数、色差值、花瓣长、果实形状和有无茸毛等，可知分子标记结果与植物性状具有一定的相关性。

3.5 化橘红种质鉴定研究对其产业发展的实际应用和意义

首先，橘红作为化州市的特色支柱产业[20]，不仅用途广泛，对于延缓咳嗽、利气消疾等病症都有着相当显著的药用功效。橘红在市面上的需求量也日益增长，除了化州道地产区在逐步扩大橘红种植规模，广西等地也在逐渐推广橘红的种植和产品[21]，相比以前，种植化橘红所带来的经济效益有着明显提高，市面上的橘红产品质量也变得参差不齐，同时许多农户在种植过程中会出现把橘红种质混淆的情况。对产区内的橘红种质进行种质鉴定，既可以应对市面需求，一定程度上解决品种混乱和品种优劣的问题[22]，又能最大限度保证高质量橘红种质的种植和产业化生产，为市场源源不断地提供高质量橘红产品，也可给当地农户带來可观的收益。

其次，虽然在大多数情况下，化橘红的中药活性成分是由其种质特性决定的，但其对环境也有较大的依赖性[23]：一方面，化橘红作为道地药材，其道地产区的生态环境对化橘红的独特品质形成和保持有着极强的相关性[24]，土壤作为植物生长的养分库，其成分的含量和变化都会影响到橘红的生理代谢过程及体内各种药用化合物的合成和变化[25]；另一方面，气候也是影响橘红生长的一个重要因素，气候条件若发生较大的变化，会直接影响到橘红的生长发育[26]，进而影响其化学成分的含量。作为道地中药材，橘红的价值还是体现在其化学成分上，如何保证化橘红果实的质量和化学成分的含量始终贯穿着整个生产过程[27]，让橘红在整个生长周期中保持果实健康发育，提高化学成分含量才是橘红产业蓬勃发展和保持竞争力的第一要务。作为橘红的道地产区，对化州各个种植区的橘红种质进行鉴定，以当地高质量的橘红产品作为各项指标的标准，可为其他橘红产区提供一个模板和参考，从而促进其橘红产品的质量提升以及产业发展；此外，通过合适的鉴别方法，各橘红产区也可对当地橘红产品进行各项指标的检验和对比，如定期观察物候期、测定各项植物学性状指标和化学成分的含量变化等，并根据所测定的结果为之后的产业化种植制定更详细的计划，这将有利于整个橘红产业更长远、更健康地发展。