剑麻均一化文库构建及PnRXLR5863靶蛋白筛选

杨子平　杨倩　汪询　柯智　鹿志伟　张燕梅　谌惠邦　周文钊

关键词：RXLR 效应蛋白；剑麻；均一化文库；蛋白质相互作用；斑马纹病

中图分类号：S432.1 文献标识码：A

效应蛋白是病原微生物产生的一类有利于病原微生物侵染的蛋白质。卵菌中存在数量庞大的效应蛋白基因，其中RXLR 类效应蛋白的数量最多。大豆疫霉约含有396 个编码RXLR 效应蛋白的基因，拟南芥霜霉菌有134 个，橡树疫霉菌有374 个，马铃薯疫霉菌有563 个，葡萄霜霉菌有100 个，烟草疫霉存在超过300 个[1-2]。RXLR 效应蛋白的N端含有约20 个氨基酸的信号肽，在第40～90 位氨基酸处含有一个保RXLR 基序，之后为序列多态性的效应分子功能区域，存在数量不等的W、Y 或者L 基序[3]。RXLR 为胞内效应蛋白，可以抑制植物ROS 的产生、胼胝的沉淀和SA 的含量等基础防卫反应。进一步研究发现，RXLR 效应蛋白能通过C端功能域结合寄主内靶蛋白，调节寄主靶蛋白功能， 抑制或者干扰寄主多个生理事件。例如Hyaloperonospora arabidopsidisd 的HaRxLL470 与HY5 相互作用并抑制防御相关基因的转录[4]；大豆疫霉（Phytophthora sojae）的PsAvr3c 与剪切体SKRP 蛋白互作，导致防卫相关蛋白的Pre-mRNA剪切异常[5]；致病疫霉（Phytophthora infestans）的PITG20303 靶向并稳定马铃薯免疫负调控因子丝裂原活化蛋白激酶StMKK1，影响水杨酸信号通路[6-7]；大豆疫霉（P. sojae）的PsAvh262 稳定内质网蛋白BiPs，引起细胞坏死[8-9]。

卵菌属烟草疫霉引起的斑马纹病，是剑麻生产中的主要病害。烟草疫霉通过游动孢子侵染剑麻的叶片，初期引起斑马纹的病症，之后逐步引起叶腐和茎腐[10]。目前关于剑麻斑马纹病的研究还处在病原物的分离鉴定、病原流行性方面，而对烟草疫霉侵染剑麻的致病机制缺乏深入研究。

本课题组已对侵染剑麻不同时间的烟草疫霉进行了转录组测序，转录组检测到214 个编码RXLR的基因。其中PnRXLR5863 表达水平高且表达水平变化显著，其编码的蛋白N 端含有信号肽和RXLR-EER 结构域，C 端含有W 和Y 功能结构域。在烟草叶片中瞬时表达PnRXLR5863，能引起细胞死亡，推测PnRXLR5863 是侵染剑麻的关键RXLR 效应蛋白，但是PnRXLR5863 作用剑麻的靶蛋白和作用分子机制还不清楚。因此，本研究构建了剑麻酵母双杂交均一化cDNA 表达文库，筛选了与PnRXLR5863 相互作用的靶蛋白。结果为深入研究PnRXLR5863 的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

剑麻（Agave hybrid No.11648）采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻种质保存圃；Trizol 购自Invitrogen 公司；Oligo（dT）、DNA cleanbeads 和PCR mix 磁珠购自诺唯赞公司；均一化试剂盒购自Evrogen 公司； 反转录试剂盒、Hi-Fusion 试剂盒、EcoR I、双链cDNA 纯化、酵母转化和文库构建试剂盒购自Clontech 公司；用于配制酵母培养基的试剂和其他试剂购自Sigma-Aldrich 公司。引物合成与DNA 测序委托广州艾基生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 的提取 采集Agave hybrid No.11648植株叶片，液氮速冻。将样品研磨成粉，Trizol 法提取其总RNA。采用Oligo（dT）磁珠纯化mRNA。

1.2.2 RNA 的反转录 反应体系中加入1.0 μLCDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物，1～500 ng 的mRNA，DEPC H2O 补齐到5 μL，72℃ 3 min，立即置于冰上。之后依次加入1.0 μL DTT，1.0 μLdNTP，1.0 μL MMLV Reverse Transcriptase，2.0 μL5×First-Strand buffer，42℃ 90 min，然后70℃15 min 终止，冷却至室温，加入1 μL RNase H，37℃ 30 min，产物存放于?80℃保存。CDS Ⅲ引物和SMART Ⅲ引物序列见表1。

1.2.3 双链cDNA 的合成 2.0 μL 单链cDNA，2.0 μL 5' PCR 和3' PCR 引物，25 μL Advantage 2Polymerase Mix 合成双链cDNA，加水补齐到50 μL。PCR 扩增条件为：95℃ 3 min；95℃ 15 s；60℃ 15 s；72℃ 6 min，72℃ 10 min，30 個循环。5' PCR 引物和3' PCR 引物序列见表1。

1.2.4 双链cDNA 的纯化 将1.2 倍样品体积的磁珠液与双链cDNA 混匀，室温孵育10 min，转移到磁力架上，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。200 μL 新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠（不要搅动磁珠），室温孵育30 s，小心移除上清；室温下开盖干燥磁珠5～10 min，加入30～50 μL 无核酸酶ddH2O，室温静置2 min，小心吸取上清至一个新的无核酸酶EP 管中。

1.2.5 cDNA 均一化 按照以下体系进行杂交：1 g ds cDNA，8 μL 2×Hybridization buffer，水补齐到16 μL，将上述溶液平均分成4 份，置于0.2 mLPCR 管中；PCR 仪上98℃放置2 min，迅速转移到准备好的68℃ PCR 仪中5 h。按照以下体系进行DSN 消化：4 μL 杂交后的cDNA，5 μL 2×DSNmaster buffer （68℃预热），1 μL DSN solution （分别为DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水补齐到16 μL，68℃反应25 min。按照以下体系进行PCR 放大：10 μL 2×DSN stop buffer，室温放置5 min。5 μL 10×Advantage 2 PCR buffer，1 μL50×dNTP Mix，1.5 μL Primer M1，1 μL 50× Advantage2 Polymerase Mix，1 μL 消化后产物（即DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水补齐到50 μL。PCR 扩增条件为：95℃ 1 min；95℃ 15 s；66℃20 s；72℃ 3 min，11 个循环。

1.2.6 cDNA 小片段去除 预先将CHROMASPINTM TE-400 纯化柱中胶体和缓冲液混合均匀，瞬时离心弃液体。将93 μL 双链cDNA 加入纯化柱胶体，700 g 离心5 min。向收集液中加入2.5倍体积无水乙醇和1/10 体积的3 mol/L 乙酸钠（NaAc），置于?20℃沉淀DNA。用20 μL 无菌水溶解沉淀物，并测定双链cDNA 浓度。

1.2.7 双链cDNA 与pGADT7（lineared）同源重组 按照以下体系进行同源重组：2 L ds cDNA，50～200 ng pGADT7，4 μL 5×CE II buffer，2 μLExnase II，水补齐到20 μL，在37℃反应30 min，置于冰上。按照以下体系进行产物纯化：20 μL重组产物，2 μL 核酸助沉剂，55 μL 100%乙醇，混匀后于?20℃放置30 min，13 000 r/min 离心15 min，弃上清；加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，8000 r/min 离心2 min ， 弃上清； 室温下晾5～10 min，加入10 μL TE buffer 溶解沉淀。

1.2.8 文库构建 将10 μL 重组产物电击转化至50 μL 电转感受态中，取10 μL 菌液稀释10 000倍后，从中取100 μL 涂布于含Amp 抗生素的LB平板，37℃倒置过夜培养。剩余菌液加入甘油至终浓度为20%即为文库菌液。

1.2.9 文库质量检测 文库库容（CFU/mL）=克隆数/涂布体积稀释倍数。总克隆数（CFU）=库容菌液总体积。PCR 克隆鉴定体系如下，10 μL2× PCR Mix，1 μL T7-F，1 μL 3AD，水补齐到20 μL。PCR 扩增条件为：95℃ 3min；95℃ 15 s；55℃ 15s；72℃ 5 min，72℃ 5 min，25 个循环。

1.2.10 诱饵载体构建 设计携带EcoR I 酶切位点的特异引物（表1），扩增PnRXLR5863 编码框。将PnRXLR5863 编码框插入pGBKT7 载体，构建诱饵载体。

1.2.11 诱饵载体自激活检测 将pGBKT7-PnRXLR5863 载体转化AH109 酵母菌株，转化液涂布于不含色氨酸的培养基（SD/-Trp），30℃恒溫培养3～4 d。随机挑取6 个点，用pGBKT7 的载体引物进行PCR 验证，随机取3 个正确克隆点板至SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 板上，30℃培养3～5 d。其中pGBKT7 为阴性对照。

1.2.12 互作蛋白筛选 制备AH109 酵母感受态，将文库质粒和诱饵质粒pGBKT7-PnRXLR5863共转化AH109 酵母菌，转化液涂布于SD/-Trp/-His/-Ade 筛选平板。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

为了鉴定所提取的RNA 是否能用于下游建库，从中吸取2 μL 进行琼脂糖电泳检测和分光光度计测量。结果显示，能清晰地看到28S 和18S两条带，5S 条带很弱甚至无，表明所提RNA 完整性好，无降解（图1A）。OD260/OD280 在1.8～2.2之间，表明RNA 纯度高；OD260/OD230 大于2，表明糖类、盐类、有机溶剂等去除干净。因此，所提取RNA 可用于下游建库。

2.2 cDNA 的合成

为了判断所获得的ds cDNA 是否合成，PCR结束后取5 μL 进行琼脂糖电泳检测。结果显示ds cDNA 呈现弥散条带（图1B），表示各种大小的条带都有，合成的cDNA 质量较好。

2.3 cDNA的纯化

为了检测小片段是否去除，从纯化后的溶液里边吸取5 μL 进行琼脂糖电泳检测。结果显示ds cDNA 呈弥散条带，500 bp 以下几乎看不到条带，表明小片段去除干净（图1C）。

2.4 克隆计数

为了确定文库库容，对电转化液稀释10 000倍。经培养，平板上克隆约为532 个，根据公式计算得到库容为5.32×107 CFU/mL ， 总克隆数为1.064×108 CFU（图2）。

2.5 文库质量鉴定

为了检测文库的条带分布，从平板上随机挑选24 个克隆进行菌落PCR。检测结果显示，文库条带在1000 bp 上下出现，说明文库片段平均大小在1000 bp（图3）。

2.6 自激活检测

为了检测诱饵载体是否有自激活，将含诱饵载体的酵母菌点至SD/-Trp 、SD/-Trp/-His 、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 平板上。结果显示，阴性对照pGBKT7 能在SD/-Trp平板上生长，在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 平板上均不能正常生长。实验组与对照组生长一致（图4）。结果说明诱饵载体无自激活现象。

2.7 靶蛋白筛选

为了获得阳性克隆，从SD/-Trp/-Leu/-His 筛库平板上挑取了96 个克隆（图5），转板培养一次，对这96 个克隆进行PCR 扩增并对PCR 产物测序，测序结果与GenBank 数据库中的序列进行BLAST 比对分析，去除重复获得23 个阳性克隆（表2）。蛋白功能注释结果显示，这些蛋白主要参与分子功能和生物过程，涉及泛素化过程、蛋白合成、蛋白翻译和蛋白修饰等生理事件。

2.8 阳性克隆回转验证

将阳性克隆与诱饵载体共转化AH109 酵母菌，点板至SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板，进行阳性克隆的回转验证。结果显示（图6），阳性对照能在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上生长，并能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上显蓝色；阴性对照仅在SD/-Trp/-Leu 平板上能生长，而在其他平板均不能生长。

23 個阳性克隆能在SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His 缺陷型平板上生长，8 个阳性克隆能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 平板上生长，并能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上显蓝色。

3 讨论

酵母双杂交是目前能够进行高通量筛选相互作用蛋白的技术之一，文库质量直接影响互作蛋白的筛选。通常通过文库基因的完整性和复杂性来评估cDNA 文库的质量。cDNA 序列的完整性和丰度决定了文库的完整性，mRNA 序列的完整直接影响cDNA 系列的完整性。采用SMART 技术构建cDNA 文库，要求实验材料少、操作简单、快速[11]，能够较真实地反映样品中转录本的表达水平，但是低丰度表达基因容易在文库构建过程中丢失，且不利于筛选获得低丰度表达基因，高丰度表达基因也会给筛选带来一定的困难[12]。而利用DSN 酶处理cDNA，能降低高表达基因的拷贝，增加低丰度基因的拷贝[13]，提高筛库获得低丰度表达基因的几率。文库的完整性可以通过库容来进行量化评估，高质量文库的库容至少为106 CFU，低于此指标，不利于获得阳性克隆[11]。文库片段正确表达可以增加文库的复杂性，通过合成三框cDNA 来实现文库复杂性，目的是保证文库片段都能表达出与样本体内相同的蛋白[13]。这样，一方面能增加获得互作蛋白的概率，另一方面也能减少假阳性。为了构建高质量的剑麻酵母cDNA 表达文库，本研究从总RNA 中纯化了mRNA，采用三框引物合成cDNA，利用DSN 对cDNA进行均一化，SMRT技术构建重组文库质粒，最后将质粒电击转化大肠杆菌，构建了一个文库片段平均大小在1000 bp、库容为5.32× 107 CFU/mL、总克隆数为1.064×108 CFU 的均一化文库。

在之前的研究中，为了筛选与剑麻AhKNOX2蛋白相互作用的蛋白，以健康剑麻叶片总RNA 反转录获得的cDNA 为材料，采用体内同源重组的方式，在酵母体内构建了一个酵母双杂交文库，其文库总容量为3.9106 CFU，插入片段大小主要分布于0.5～3.0 kb 之间，重组率为92%[14]。与前一个文库构建不同的是，为了筛选与病原菌效应蛋白互作的剑麻靶蛋白，选用烟草疫霉侵染的剑麻叶片为材料，目的是激发剑麻抗病基因的表达。为排除文库编码核糖体蛋白的cDNA 的插入，以及确保文库插入cDNA 能正确表达，从总RNA中纯化了mRNA，并采用了三框引物对mRNA 进行反转。为了降低高表达基因的丰度和提高低表达量基因的丰度，本研究对合成的双链cDNA 进行了均一化。此外，为了提高转化效率，本次采用体外同源重组和电击转化，在大肠杆菌中构建表达文库。由文库质量评估可知，新文库的库容量达到107，比前一个文库提升一个数量级。剑麻CDS 平均长度为1087 bp（未公布的基因组数据），新老文库筛选获得的阳性克隆插入片段平均长度为920 bp 和1050 bp，排除由于诱饵蛋白功能导致的靶蛋白的差异，2 个文库的插入片段均有较好的完整性。

RXLR 是卵菌中第一大类效应蛋白，能够通过与寄主防御蛋白结合，在表观修饰水平抑制抗病基因转录[15-16]；在转录水平抑制寄主防卫基因的转录[4， 17-18]；在转录后水平干扰寄主防卫基因的翻译[5， 19]；干扰寄主信号转导[6-7， 20-22]；调控自噬[23]；调控细胞间运输[24]；介导内质网应激[8-9]；操纵活性氧信号[25]。本研究以PnRXLR5863 为诱饵，通过酵母双杂交从剑麻文库中获得23 个互作蛋白。已知功能的16 个蛋白，涉及泛素化过程、蛋白合成、蛋白翻译和蛋白修饰等生理事件。推测烟草疫霉侵染剑麻过程，PnRXLR5863 效应蛋白可能作用于剑麻的蛋白代谢。