CD34 在甲状腺乳头状癌中的表达及其与临床病理特征的关系

曾红春，杨育生，郑维喆，钱秀红

1.上海市松江区中心医院超声科，上海 201600；2.上海市松江区中心医院病理科，上海 201600

甲状腺癌具有较高的人群患病率，病理类型多为甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。尽管PTC 具有良好的临床预后和长期伴癌生存期，仍有10%～15%的患者发生复发、转移和与癌症相关的死亡[2]。既往研究认为血管因素参与了甲状腺乳头状癌的转移过程，由于PTC 在不同的生长阶段，结节内部可发生不同的纤维化和钙化，微血管数量也会随之发生变化。迄今，关于PTC 微血管化状态与其临床病理特征之间的关系尚存有争议[3-5]。本研究收集2014年1月—2021年11月在上海市松江区中心医院行甲状腺手术患者169 例（176 个结节）的临床病理资料，拟分析CD34 在PTC及甲状腺良性结节中的表达，采用全景模式下计数单位面积的微血管密度（microvascular density，MVD），比较分析PTC 与甲状腺良性结节间、PTC 侵犯组与无侵犯组间、PTC 伴或不伴桥本氏甲状腺炎间MVD 的相关性，以期进一步了解CD34 表达与其临床病理特征的内在联系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集在本院行甲状腺手术患者169 例（176 个结节）的临床病理资料，其中，男28 例，女141 例；年龄22～84 岁，平均（53.74±11.54）岁。良性组99个（结节性甲状腺肿57 个、桥本氏甲状腺炎24 个、滤泡状腺瘤18 个），结节最大径0.6～4.0 cm。恶性组77 个（均为甲状腺乳头状癌），结节最大径0.2～2.5 cm。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①资料完整；②术前未接受任何治疗；③标本满足CD34 染色标准；④CD34 着色良好。

排除标准：①资料不完整者；②术前接受过治疗者；③标本不满足CD34 染色标准者；④CD34 着色差者。

1.3 方法

①研究分组：病理结果和临床资料中显示有包膜侵犯、脉管或血管侵犯以及淋巴结转移或远处转移任何一项者为侵犯组，无上述任何病理特征者为无侵犯组。按照肿瘤周围组织是否伴有桥本氏甲状腺炎，将患者分为桥本氏甲状腺炎背景和非桥本氏甲状腺炎背景。

②CD34 免疫组织化学染色：采用EnVision 二步法染色，石蜡切片4 µm，70℃烘箱不少于1.5 h，石蜡切片脱蜡，用EDTA（pH=8.0）98℃微波修复10 min，自然冷却至室温，流水冲洗，PBS液（pH=8.0）清洗3次，1 min/次。用0.3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶灭活10 min，PBS 液（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次。CD34 工作液（鼠单抗，克隆号QBEnd/10）室温孵育60 min，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution,PB）（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次。然后用Haopoly-HRP 鼠/兔通用二抗试剂盒室温孵育15 min，PBS 液（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次，二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显色5 min，用流水反复冲洗，复染30 s，用1%盐酸酒精分化，温水进行蓝化、组织脱水透明、树胶封片。镜下血管内皮细胞染成棕黄色为CD34 阳性。

1.4 观察指标

采用K-Viewer 病理图像阅读器进行全景读片，由两位高年资医生在低倍镜下（×20）选择热点最高的区域，然后在高倍镜（×40）下进行单位面积下（50 000 µm2）的微血管计数（条/单位面积），计数3次取平均值；所有数据资料均存图留档，初次评估完成后1 周，采用双盲法按照同样方法复测1 次，两次结果取平均值。计数标准：①避开坏死液化和纤维化区；②棕染的内皮细胞或细胞丛认定为单个微血管；③独立成条或分支结构未中断者按1 条计数。

1.5 统计方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以(±s)表示，组间差异比较采用t检验；计数资料以频数和百分率（%）表示，组间差异比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺良恶性结节间MVD 比较

PTC 组CD34 表达量显著高于良性组，见图1、图2。PTC 组MVD（30.610±11.513）条/单位面积高于良性组（23.160±10.362）条/单位面积，差异有统计学意义（t=4.506，P＜0.001)。

图1 PTC 组织CD34 表达，EnVision 法(×200)

图2 结节性甲状腺肿CD34 表达，EnVision 法(×200)

2.2 MVD 与PTC 最大径的相关性分析

不同大小PTC 结节间MVD 比较，差异无统计学意义（F=0.580，P=0.630），见表1。采用Spearman 相关性分析PTC 最大径与MVD 的相关性，结果显示，PTC 最 大 径 与MVD 间 无 相 关 性（r=-0.052，P=0.651）。

表1 不同大小PTC 结节MVD 的比较[(±s),条/单位面积]

表1 不同大小PTC 结节MVD 的比较[(±s),条/单位面积]

最大径（mm）≤5（n=33）6～10（n=31）11～15（n=9）＞15（n=4）MVD 24.550±9.757 25.550±9.212 21.440±7.970 21.750±6.238 F 值0.580 P 值0.630

2.3 MVD 与PTC 侵袭性的相关性分析

PTC 侵犯组与无侵犯组间MVD 比较，差异无统计 学意义（t=-0.484，P=0.630），见表2。两组 间Spearman 相关性分析显示，MVD 与PTC 侵袭性无相关性（r=0.157，P=0.172）。

表2 甲状腺乳头状癌侵犯组与无侵犯组间MVD 的比较[(±s),条/单位面积]

表2 甲状腺乳头状癌侵犯组与无侵犯组间MVD 的比较[(±s),条/单位面积]

组别侵犯组（n=17）无侵犯组（n=60）MVD 29.410±10.932 30.950±11.739 t 值-0.484 P 值0.630

2.4 PTC 伴桥本氏甲状腺炎与不伴桥本氏甲状腺炎间MVD 的比较

PTC 伴桥本氏甲状腺炎与不伴桥本氏甲状腺炎间MVD 比较，差异无统计学意义（t=0.651，P=0.517），见表3。桥本背景与非桥本背景PTC 患者发生侵犯的概率比较，差异无统计学意义（χ2=0.085，P=0.771），见表4。

表3 PTC 伴桥本氏甲状腺炎与不伴桥本氏甲状腺炎间MVD 比较[(±s),条/单位面积]

表3 PTC 伴桥本氏甲状腺炎与不伴桥本氏甲状腺炎间MVD 比较[(±s),条/单位面积]

不同背景桥本背景（n=14）非桥本背景（n=63）MVD 32.430±13.993 30.210±10.978 t 值0.651 P 值0.517

表4 桥本氏甲状腺炎背景和非桥本氏甲状腺炎背景下PTC 侵犯组和非侵犯组间比较

3 讨论

新生血管是恶性肿瘤赖以生存的基础[6]。PTC 结节内部的微血管状态在不同生长阶段呈动态性变化[7-8]。不同的生长周期，PTC 结节可发生不同程度的纤维化和钙化，致使微血管结构遭到破坏，PTC 结节MVD（38.0±6.1）条/高倍视野低于良性结节（62.5±13.5）条/高倍视野（P＜0.05），同时导致结节内部微血管分布不均匀，结节内部的MVD 低于周围正常甲状腺组织，PTC 与甲状腺组织交界处MVD 高于中央区[4]。李刚等[9]研究表明超声造影后PTC 结节实测值小于灰阶超声模式下的测量值，而良性结节超声造影测值与灰阶超声模式下测值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），这一征象也间接表明PTC 结节的微血管分布状态不均衡，周边的新生血管较中央丰富。因此，既往的研究结果普遍认为PTC 是乏血供的肿瘤。随着对PTC 的深入研究，有学者在超声造影过程中发现，部分PTC 出现“造影剂滞后”的现象，这部分PTC内部MVD 的集成光密度值（integrated optical density value, IOD）明显高于不出现“造影剂滞后”的结节[10]。温群等[5]研究也显示PTC 的MVD（51.77±36.50）条/高倍视野高于甲状腺良性结节（38.48±26.21）条/高倍视野（P＜0.05）,本研究结果显示，PTC 组MVD（30.610±11.513）条/单位面积高于良性组（23.160±10.362）条/单 位 面 积（P＜0.05），表 明PTC 也可以具有富血管化的特征。

结节大小被认为是PTC 的风险预测因素，随PTC 体积增大，BRAFV600E 突变率增加，PTC 体积增大与被膜侵犯、CAF 增生密切相关[11]。然而，各项研究得出的PTC 最大径的预测诊断界值差别较大，从6.5～40 mm 不等，很难将PTC 的大小直接作为量化的风险预测指标[12-14]。导致研究结果差异性较大的原因可能与PTC 的组织生物学特性有关。肿瘤的大小由肿瘤的生长速度决定，而生长速度的快慢又与新生血管有着直接关系。当肿瘤快速生长时，在多种促血管生成因子的作用下，新生血管大量增生，以满足快速生长的需要，此时PTC 拥有较为丰富的血管网。随着肿瘤的继续增大，肿瘤异质性和浸润性生长的特点可引起新生血管损伤，结节内部出现纤维化和钙化，导致PTC 新生血管数量减少和分布不均衡。因此，不同生长阶段PTC 结节的大小与MVD 并非总是呈现为正相关，本研究结果显示不同大小PTC 结节与MVD 间无相关性（P＞0.05），这一研究结果符合PTC 的动态性病理变化。

有研究认为MVD 与PTC 的侵袭性相关，高危组PTC 患者以及有甲状腺外和局部血管侵犯患者的MVD 显著高于非侵犯组PTC（P＜0.05）[15]。MVD 除了与血管侵犯有关外，还与淋巴结转移有密切的相关性[16]。但在另外一项研究中，MVD 在PTC 伴有淋巴结转移和不伴有淋巴结转移组间差异无统计学意义（P＞0.05），MVD 与淋巴结转移没有相关性[17]。本研究结果显示，侵犯组与非侵犯组间MVD 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），MVD 与PTC 的侵袭性之间无显著的相关性（P＞0.05）。从PTC 的组织生物学特性考虑，PTC 在进展过程中新生血管会遭到动态性破坏，使得血管化的进程受到阻遏。桥本氏甲状腺炎背景与PTC 发生发展的相关性日益受到关注，有研究显示，罹患桥本氏甲状腺炎的患者，甲状腺恶性肿瘤的发生率将会提高，尤其是PTC、甲状腺髓样癌和淋巴瘤[18-19]。这部分患者发生BRAFVE600基因突变的概率明显高于未合并桥本氏甲状腺炎的患者[20]。一项关于PTC 侵袭性风险因素的回归性研究表明，只有多灶性PTC 合并桥本氏甲状腺炎是淋巴结转移的危险因素，而桥本氏甲状腺炎尚不构成独立危险因素[21]。本研究显示，PTC伴有桥本背景与不伴桥本背景的MVD 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），PTC 伴有桥本氏甲状腺炎和不伴有桥本氏甲状腺炎发生侵袭性的概率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。由于纳入研究的桥本氏甲状腺炎患者的例数较少，桥本氏甲状腺炎背景是否是PTC 侵袭性的风险因素，仍有待于进一步研究。

综上所述，PTC 的MVD 高于甲状腺良性结节，这一研究结果符合恶性肿瘤的组织生物学特性。而PTC 的血管化状态与PTC 的大小、侵袭性及桥本氏甲状腺炎背景无明显相关性。