3株马尾松外生菌根真菌菌丝最适生长条件探究*

孙启彪，毛 莹，钱 璐，季晓红，何贞英，欧阳建萍，陈 晔，何 刚**

（1.九江学院 药学与生命科学学院，江西 九江 332000；2.九江市真菌资源保育及应用重点实验室，江西 九江 332000；3.九江学院 资源环境学院，江西 九江 332005）

外生菌根（Ectomycorrhizal，ECM）真菌是土壤中非常重要的一类活体营养型真菌，能与松科（Pinaceae）、壳斗科（Fagaceae）、桦木科（Betulaceae）等高等植物细根形成外生菌根共生体，在促进植物水分和矿质养分吸收及提高环境适应性中发挥了重要作用，广泛应用于植树造林、土壤重金属污染修复及生态恢复[1]。多数ECM 真菌能够形成大型子实体，且许多种类具有极高的食（药）用价值[2-3]。然而，ECM 真菌在与植物共生演化过程中，其腐生能力不断退化，如植物细胞壁相关降解酶基因丢失[4]。在自然界中，ECM 真菌主要依赖共生植物将蔗糖、淀粉等水解成单糖后吸收利用，而不能直接利用植物的光合产物，原因是这类真菌缺少相关的基因，如双色蜡蘑（Laccaria bicolor）的基因组缺乏双糖运输蛋白、蔗糖转化酶等基因[5-6]。尽管多数种类可以离体培养，但菌丝生长缓慢，对人工合成菌根以及仿野生人工栽培造成了困难，限制了ECM真菌的开发应用[7-8]。不同类型ECM 真菌的最适生长条件具有明显差异，如正红菇（Russula griseocarnosa）和橙黄硬皮马勃（Scleroderma citrinum）的最适碳源为甘露醇，最适氮源均为硝酸盐[9]；点柄粘盖牛肝菌（Suillus granulatus）的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为铵盐[10]。因而，探究不同ECM 真菌的营养条件有利于发掘其生态功能和食（药）用价值。纯培养是研究ECM 真菌的前提与基础，包括菌种的扩繁、菌剂的制作、菌根合成。

研究通过对小笠原须腹菌（Rhizopogon boninensis）、硬皮地星（Astraeus hygrometricus）和彩色豆马勃（Pisolithus tinctorius）3 种具有食（药）用价值的ECM 真菌进行菌丝生长最适温度、pH、碳氮比的试验和不同碳源、氮源利用效率的试验，探究其纯培养的最适营养和生长条件，掌握其生物学特性，为进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

小笠原须腹菌（S021）、硬皮地星（S180）和彩色豆马勃（S202）菌种由九江市真菌资源保育及应用重点实验室提供，3 株真菌均分离自与马尾松共生的子实体，采集地分别为九江市白鹿镇观音桥、上饶市铜钹山和九江市庐山西海。

1.2 供试培养基

MMN（Modified Melin-Norkrans,MMN）培养基：CaCl20.05 g·L-1、（NH4）2HPO40.25 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1、NaCl 0.025 g·L-1、1% FeCl31.2 mL·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、VB1100 μg·L-1、葡萄糖10 g·L-1、麦芽浸膏0.5 g·L-1，pH 为5.5。

改良MMN 培养基：CaCl20.05 g·L-1、（NH4）2HPO40.25 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1、NaCl 0.025 g·L-1、1% FeCl31.2 mL·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、VB1100 μg·L-1、葡萄糖10 g·L-1，pH 为5.5。

试验仪器：HDL-CJ-2NDI 超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；LDZX-50KBS 压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；MJ-160BSH-Ⅱ霉菌培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；PHS-3C雷磁pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 最适pH 试验

用1 mol·L-1HCl 或1 mol·L-1NaOH 溶液将改良MMN 培养基的pH 分别调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在121 ℃、0.05 MPa 条件下灭菌20 min 后倒入培养皿（直径60 mm）。将在固体MMN 培养基上活化复壮后的ECM 真菌菌落，用无菌打孔器（内径为5 mm）在菌落边缘打取长势旺盛的菌块，接种于不同pH 的改良MMN 固体培养基中央，置于25 ℃恒温箱内倒置培养14 d，每天观察其长势，并用“十”字交叉法测量菌落直径，每组处理设5 个重复。

1.3.2 最适温度试验

将活化后的试验菌株接种于改良MMN 培养基，分别置于10 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃恒温箱内倒置培养14 d，每组处理设5 个重复。接种和测量方式同1.3.1。

1.3.3 碳源利用试验

将改良MMN 培养基中的碳源葡萄糖分别替换为等量的果糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、微晶纤维素，每组处理设5 个重复。接种、培养和测量方式同1.3.1。

1.3.4 氮源利用试验

将改良MMN 培养基中的氮源（NH4）2HPO4分别替换为含等量氮素的尿素、硝酸钠、胰蛋白胨、甘氨酸、色氨酸，每组处理设5 个重复。接种、培养和测量方式同1.3.1。

1.3.5 最适碳氮比试验

以改良MMN 固体培养基为基础培养基，固定碳源的质量，通过添加不同质量的氮源（NH4）2HPO4使培养基的碳氮比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、40∶1，每组处理设5 个重复。接种、培养和测量方式同1.3.1。

1.4 数据处理

数据处理均在Excel 2016 中完成，菌落图片处理和图表绘制分别使用Photoshop 2020 和Origin 2022 软件。

2 结果与分析

2.1 pH 对ECM 真菌生长的影响

pH 是影响ECM 真菌菌丝生长和新陈代谢的重要因素之一，通常情况下，偏酸性环境更有利于真菌的生长。pH 对ECM 真菌菌丝生长的影响情况见图1。

图1 不同pH 条件下ECM 真菌培养14 d 菌落特征与生长过程的直径变化Fig.1 Colony characteristics cultured for 14 days and diameters during cultivation of ectomycorrhizal fungi under different pH conditions

从图1 可知，pH 对小笠原须腹菌、硬皮地星和彩色豆马勃的生长具有显著影响。小笠原须腹菌在pH 为4～9时均能生长，具有较强的适应能力，其中酸性条件更有利于菌丝生长，最适pH 为5，此条件下培养14 d 后菌落直径为（4.60±0.10）cm。硬皮地星在pH 为5～7 时菌丝长势较好，但菌落特征具有明显差异，pH 为5～6 时菌丝绒毛状，pH 为7 时菌丝致密，pH≥7 时培养基中产生褐色或棕色色素。彩色豆马勃在不同pH 条件下的生长特征和硬皮地星相似，最适pH 为6，培养14 d 后菌落直径为（2.13±0.06）cm。

2.2 温度对ECM 真菌生长的影响

温度是影响真菌代谢和生长的重要因素，温度对ECM 真菌菌丝生长的影响情况见图2。

图2 温度对ECM 真菌菌丝生长的影响Fig.2 Effect of temperature on themycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由图2 可知，3 株真菌可生长温度范围具有明显差异。小笠原须腹菌和硬皮地星在低温（10 ℃）或高温（35 ℃）条件下均不能生长，小笠原须腹菌最适生长温度为25～30 ℃，硬皮地星最适生长温度为25 ℃。彩色豆马勃的温度适应性与小笠原须腹菌和硬皮地星具有明显差异，温度越高长势越好，最适温度为30～35 ℃，说明该菌属于高温型菌。

2.3 碳源对ECM 真菌生长的影响

碳源对ECM 真菌菌丝生长的影响结果见图3。

图3 碳源对ECM 真菌菌丝生长的影响Fig.3 Effect of carbonsource on the mycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由图3 可知，小笠原须腹菌、硬皮地星和彩色豆马勃可利用的碳源及对同种碳源的利用效率具有明显差异，但均不能利用半乳糖。小笠原须腹菌几乎不能利用乳糖和微晶纤维素，对蔗糖、果糖、淀粉和甘露醇的利用效果好，对葡萄糖和麦芽糖的利用效果次之。硬皮地星对蔗糖的利用效果最佳，培养14 d 后菌落直径为3.30 cm；其次是葡萄糖、可溶性淀粉和甘露醇；对微晶纤维素利用效果较差。彩色豆马勃最适碳源为葡萄糖，对蔗糖和甘露醇利用效果次之，不能利用微晶纤维素。

2.4 氮源对ECM 真菌生长的影响

氮素是组成真菌蛋白质、核酸、酶类等必需的成分，氮源的利用效率显著影响真菌的生长。氮源对ECM 真菌菌丝生长的影响结果见图4。

图4 氮源对ECM 真菌菌丝生长的影响Fig.4 Effect of nitrogen source on the mycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由图4 可知，小笠原须腹菌对磷酸氢二铵利用效果最好，培养14 d 后菌落直径为（4.30±0.06）cm；对硝酸钠和尿素的利用效果次之；不能利用甘氨酸、色氨酸等游离氨基酸。硬皮地星对磷酸氢二铵和硝酸钠均有较好的利用效果，尿素和蛋白胨次之，不能利用甘氨酸和色氨酸。彩色豆马勃对磷酸氢二铵、硝酸钠和蛋白胨有较好的利用效果，对尿素的利用效果次之，几乎不能利用甘氨酸，不能利用色氨酸。

2.5 碳氮比对ECM 真菌生长的影响

碳氮比对ECM 真菌菌丝生长的影响结果见图5。

图5 碳氮比对ECM 真菌菌丝生长的影响Fig.5 Effect of C/N ration on the mycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由图5 可知，碳氮比对ECM 真菌的生长具有显著影响，小笠原须腹菌随着碳氮比的升高越长越好。硬皮地星和彩色豆马勃适合低碳氮比培养条件，但最适碳氮比有明显差异。

3 结论与讨论

通过试验初步确定了小笠原须腹菌、硬皮地星和彩色豆马勃的营养特点和培养条件，结果表明不同菌株最适生长条件具有显著差异。温度是影响ECM 真菌生长的重要因素，多数ECM 真菌最适生长温度为25～30 ℃[9，11，13]。小笠原须腹菌和硬皮地星具有相似特点，最适生长温度为25 ℃，但彩色豆马勃喜高温，35 ℃时长势最佳。纯培养获得ECM 真菌的最适生长温度不一定反应自然土壤环境中的最适条件，菌丝生长与形成子实体所需的温度具有差异，但本研究为离体菌株的扩繁温度提供了参考。一般而言，弱酸性环境有利于多数ECM 真菌生长，最适pH 为5.0～6.0[9，11-12]。3 株ECM 真菌在中性条件下生长情况也较好，其中小笠原须腹菌具有较强的碱性耐受能力。

碳素是ECM 真菌细胞的主要组分和代谢所需能源来源，由于不同ECM 真菌在进化过程中对复杂有机质的降解能力逐渐丢失，但仍保留部分腐生能力，因此对不同碳源的利用能力具有显著差异[4]。研究中小笠原须腹菌的最适碳源为蔗糖、果糖、淀粉和甘露醇，硬皮地星最适碳源为蔗糖，彩色豆马勃最适碳源为葡萄糖，三者对复杂多糖几乎没有利用能力。牛玉蓉等[10]、宋微等[11]和柴迪迪等[13]的研究也表明ECM 真菌对碳源的利用能力具有明显差异。刘冬明等[9]研究发现，正红菇和橙黄硬皮马勃的最适碳源为甘露醇，本研究中3 株真菌也对甘露醇表现出较好的利用能力。

氮源也是真菌生长的重要限制性因素，ECM 真菌主要以铵盐作为无机氮源，有些种类对硝酸盐也有较好利用能力[14-15]。研究中3 株ECM 真菌偏好铵态氮，其中彩色豆马勃对蛋白胨、尿素等有机氮也有较好利用效果。碳氮比是影响真菌生长的因素之一，氮源比例过高易引起环境pH 偏高，碳源比例过高则容易形成较低的pH 环境。本研究发现碳氮比与ECM 真菌的最适生长pH 具有明显相关性。小笠原须腹菌偏好酸性，其在高碳氮比条件下长势明显优于低碳氮比条件；而硬皮地星和彩色豆马勃最适pH为弱酸性或中性，则在低碳氮比条件下生长较好。ECM 真菌的纯培养条件研究对菌种扩繁、菌剂生产应用及其与植物共生机制的研究具有重要价值。研究初步揭示了小笠原须腹菌、硬皮地星和彩色豆马勃的最适生长条件，但其中的相关机制有待进一步探究。