大白桩菇水解氨基酸含量的测定方法研究及其评价*

李艳婷，郭 尚**，冯 斌，徐莉娜，郭霄飞，郭伟伟

（1.山西农业大学山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.山西省检验检测中心，山西 太原 030000）

大白桩菇（Leucopaxillus giganteus）属担子菌门（Basidiomycota）伞菌目（Agricales）白蘑科（Tricholomataceae）白桩菇属（Leucopaxillus），又名雷蘑、大青蘑[1]。子实体大型，味道鲜美，营养丰富，还可治疗小儿麻疹、烦燥不安等病症[2-3]。此外，大白桩菇含有多糖、杯伞素等生物活性物质，这些生物活性物质具有清除过量自由基、提高免疫力、抗肿瘤等生物学功能[4-7]。已有研究测定大白桩菇子实体蛋白质含量为49.12 g·100-1·g-1，17 种游离氨基酸总量为33.95 g·100-1·g-1，其中必需氨基酸占比31.41%（色氨酸除外），不仅富含鲜味成分天冬氨酸和谷氨酸，且氨基酸评分（35.26）高于FAO/WHO模式的35%，所以大白桩菇具有较好的口感和风味，极具研究价值[8]。

大白桩菇作为台蘑的代表种类之一，目前对其蛋白质与水解氨基酸的相关研究却尚属空白[9]。为深入研究大白桩菇中蛋白质与氨基酸的生物活性，首先要建立氨基酸含量的测定方法。试验首次对大白桩菇中的水解氨基酸含量进行测定，对测定方法进行了方法学研究，并通过水解氨基酸含量对大白桩菇的蛋白质进行评价。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

大白桩菇采集于山西吕梁地区。该地区海拔为2 249.90 m，位于东经111°51′36″、北纬38°46′12″处，为针阔叶林和混交林地生长地带。子实体保藏于山西省农业科学院食用菌研究所，标本编号为SXSYJBB1601。

1.2 主要试剂

氨基酸混合标准溶液，塞卡姆（北京）科学仪器有限公司；浓盐酸（优级纯），太仓沪试剂有限公司；苯酚，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；氨基酸测定成品试剂包（缓冲液A、缓冲液B、缓冲液D、钾钠缓冲液、茚三酮、柠檬酸钠缓冲液），塞卡姆（北京）科学仪器有限公司。

1.3 主要仪器

S-433D 型全自动氨基酸分析仪，塞卡姆科学仪器有限公司；TVE-1100 试管浓缩仪，上海爱朗仪器有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；水浴氮吹仪器，上海那艾精密仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 大白桩菇样品制备

参考《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124-2016）[10]的方法并对其进行改进后处理样品。

将大白桩菇子实体洗净，50 ℃烘箱放置24 h，粉碎，过60 目筛，备用。准确称取50 mg 样品于20 mL 水解管中，加入6 mol·L-1的盐酸10 mL，加入3 滴新蒸馏的苯酚，充入高纯氮气后拧紧螺丝盖。将已封口的水解管置于110 ℃电热鼓风恒温箱中水解22 h，取出，冷却至室温。打开水解管，水解液过0.45 μm 滤膜，纯水冲洗水解管2～3 次，水洗液均过0.45 μm 滤膜，并全部转移至同一个50 mL 容量瓶内，去离子水定容，振荡混匀。

准确吸取1.0 mL 滤液，移入20 mL 蒸干管，使用试管浓缩仪在50 ℃环境下减压干燥，残留物用2.0 mL 去离子水溶解，再减压干燥，最后蒸干。将2.0 mL 柠檬酸钠缓冲液加入到干燥后蒸干管内溶解底物，振荡混匀后，吸取溶液过0.22 μm 滤膜，转移至仪器进样瓶，为样品测定液，供仪器测定用。

1.4.2 氨基酸混合标准工作溶液制备

氨基酸混合标准工作溶液（浓度500 μmol·L-1）的制备：精密量取2 mL 氨基酸混合标准溶液（浓度为2.5 mmol·L-1），转移至10 mL 容量瓶中，用pH 2.2 的样品稀释液（柠檬酸钠缓冲液）定容至刻度。

精密量取氨基酸混合标准工作溶液0.02、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用pH 2.2 的样品稀释液（柠檬酸钠缓冲液）定容至刻度，摇匀，得浓度为1.0、5.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 μmol·L-1的系列标准工作曲线。

1.4.3 测定条件

色谱柱编号为0208167；柱温为58 ℃；反应器温度为130 ℃；流速为0.25 mL·min-1；进样量为50 μL。

1.4.4 水解氨基酸及蛋白质评价

氨基酸成分分析评价根据氨基酸测定数据，计算大白桩菇子实体蛋白质的必需氨基酸组成，参考FAO/WHO 的标准模式进行分析[11-12]。氨基酸评分（AAS）、化学评分（CS）、必需氨基酸指数（EAAI）、生物价（BV）、营养指数（NI）按照BANO 等[13]和FAO[14]的方法进行计算与评价。根据氨基酸平衡理论，利用标准模式谱计算必需氨基酸的氨基酸比值（RAA）氨基酸比值系数（RC）[15]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

将1.4.2 制备得到的氨基酸混合标准工作溶液系列溶液置于进样瓶进行测定。波长为570 nm 处测天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸含量；波长440 nm 处测脯氨酸含量；对标准曲线进行线性回归分析。各氨基酸实际浓度（x，μmol·L-1）与峰面积（y）的线性回归方程见表1。

表1 氨基酸标准曲线线性回归方程Tab.1 Linear regression equation for amino acid standard curve

由表1 可知，半胱氨酸线性关系在0.5～50.0 μmol·L-1内良好，其他16 种氨基酸线性关系在1～100 μmol·L-1内良好。

2.2 重复性试验

称取6 份大白桩菇子实体粉0.005 g，按照1.4.1的方法制备样品测定液，测定17 种氨基酸的含量，分析6 次重复（Y1～Y6）的相对标准差RSD（relative standard deviation，RSD）。6 次重复性试验结果见表2。

表2 重复性试验结果Tab.2 Results of reproducibility test

如表2世纪，17 种氨基酸含量的RSD 均小于10%，表明方法重复性良好。

2.3 精密度试验

称取1 份（0.005 g）大白桩菇子实体粉末，按照1.4.1 的方法进行处理制备样品测定液，氨基酸分析仪上连续进样6 针进行测定。连续进样6 针检测的精密度试验结果见表3。

表3 精密度试验结果Tab.3 Results of precision test

17 种氨基酸含量的如表3世纪，RSD 均小于10%，表明精密度良好。

2.4 回收率试验

使用低、中、高3 个浓度（即标准品的质量浓度分别为10、25、50 μg·L-1）加入法测定回收率，每个浓度下测定3 个平行样品。回收率试验结果见表4。

由表4 可知，3 个不同质量浓度下回收率为80%～120%，RSD 均小于10%，表明回收良好。

2.5 水解氨基酸及蛋白质分析与评价

测定大白桩菇水解氨基酸的组成含量，结果如表5世纪。

表5 大白桩菇子实体中水解氨基酸的组成及含量Tab.5 Composition and content of hydrolyzed amino acids in the fruit body of Leucopaxillus giganteus

由表5 可知，大白桩菇共测得17 种水解氨基酸（色氨酸未测），氨基酸总含量为132.11 mg·g-1；其中必需氨基酸为43.7 mg·g-1，占氨基酸总量33.08%；非必需氨基酸88.41 mg·g-1，占比66.92%。组成药用的氨基酸有10 种，分别是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸，其含量占水解氨基酸总量的88.89%。药用氨基酸维持着人体机能的碳平衡，且某些氨基酸只能通过食物的摄取才能得到补充，说明大白桩菇具有良好的开发利用价值。药用氨基酸中谷氨酸的含量最高，占氨基酸总含量的18.09%。谷氨酸是一种神经递质，对改善人体肠道功能、脑功能、神经功能和治疗精神性疾病具有重要的作用[16-17]。其次是天冬氨酸（11.63%），说明大白桩菇可能在保护心肌、消除疲劳等方面具有调节意义[18]。天门冬酰胺和谷氨酰胺在水解过程中会产生天冬氨酸和谷氨酸[19]。大白桩菇也富含亮氨酸（6.97%），亮氨酸具有调节糖脂代谢功能，改善脂肪沉积的作用[20]。蛋氨酸和半胱氨酸含量较低，分别占水解氨基酸总量的0.83%和1.13%，可能是由于这2 种氨基酸与空气接触，发生氧化反应造成了部分氨基酸的损失[21]。

对大白桩菇水解氨基酸中人体必需氨基酸组成进行分析，并与FAO/WHO 标准模式及鸡蛋模式进行比较，计算分析各评分数值。其中，RAA 为样品中某氨基酸含量与FAO/WHO 标准模式氨基酸含量的比值，RC 为RAA 与RAA 平均数的比值，AAS 为样品中某氨基酸含量与FAO/WHO 模式谱氨基酸含量的比值乘以100，CS 为样品中某氨基酸含量与鸡蛋模式谱氨基酸含量的比值乘以100。结果详见表6。

表6 大白桩菇子实体中必需氨基酸的组成分析Tab.6 Composition analysis of essential amino acids in the fruit body of Leucopaxillus giganteus

由表6 可知，大白桩菇中蛋氨酸＋半胱氨酸占总水解氨基酸的质量分数低于标准模式谱。从必需氨基酸的氨基酸比值、氨基酸比值系数计算结果可以看出，大白桩菇中蛋氨酸＋半胱氨酸含量较低，RC 值为0.55，说明其为大白桩菇的第一限制氨基酸。在FAO/WHO 模式中，除缬氨酸外，大白桩菇其他必需氨基酸含量均高于氨基酸模式谱的要求。大白桩菇中蛋氨酸＋半胱氨酸的CS 值为35.65，说明其为大白桩菇的第一限制氨基酸，与RC 值分析结果一致。

对大白桩菇水解氨基酸的EAAI、CBV 和NI 进行分析。其中EAAI 为样品中所有必需氨基酸CS 值的几何平均数；CBV 为样品必需氨基酸指数与1.09的乘积再减去11.7；NI 为样品中必需氨基酸指数与蛋白质含量的乘积除以100。经计算，大白桩菇的EAAI 值为69.96。必需氨基酸指数（EAAI）的概念由OSER[22]提出，当EAAI＞90，说明样品的蛋白质营养价值较高；当80≤EAAI＜90 时，说明样品的蛋白质营养价值为良；当EAAI＜70，说明样品的蛋白质营养价值较低。因此，大白桩菇的营养价值接近良。生物价越高表示可利用程度越高，CBV 与EAAI 之间的关系呈线性，趋势与EAAI 一致。营养指数（NI）方法中包括粗蛋白含量与必需氨基酸组成，以此进行综合评价，故评价更为全面和准确。大白桩菇营养指数为34.36，因大白桩菇粗蛋白含量较高，所以营养指数较高，且超过了鸡腿菇（Coprinus comatus）、香菇（Lentinus edodes）、茶树菇（Agrocybe aegirit）和黑木耳（Auricularia auricula）等常见食用菌[23]。

3 结论与讨论

在国家标准《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124-2016）的基础上，增加了半胱氨酸含量的测定方法，对样品处理方法进行了改进，将改进方法用于大白桩菇子实体中17 种水解氨基酸的测定，并进行了方法学验证分析。结果表明，本方法具有线性关系良好、结果准确、重现性好、回收率高的特点，可用作大白桩菇中17 种水解氨基酸的测定方法。大白桩菇水解氨基酸测定方法的建立对进一步研究大白桩菇蛋白质的营养价值具有重要意义。

研究表明大白桩菇是一种高蛋白野生食用菌，粗蛋白含量高达49.12 g·100-1·g-1。本试验中测定大白桩菇17 种水解氨基酸总含量为132.11 mg·g-1。其中，必需氨基酸43.7 mg·g-1，占氨基酸总量的33.08%；药用氨基酸总量为88.89 mg·g-1，占氨基酸总量的67.28%。与FAO/WHO 模式和鸡蛋模式相比，大白桩菇第一限制氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸。除缬氨酸外，大白桩菇其他必需氨基酸含量均高于氨基酸模式谱的要求。大白桩菇的必需氨基酸指数为69.96，表明其营养价值接近良好，而与其蛋白质含量相结合计算后，其营养指数达到34.36，表明大白桩菇营养价值较高，且超过香菇、黑木耳等常见食用菌。综上所述，大白桩菇是一种氨基酸分布均衡，且营养价值较高的高蛋白食用菌。