张一平,薛 璟,张 辰,张 蕾,季宏更,蒋 益
(江苏省苏微微生物研究有限公司,江苏 无锡 214063)
糖蛋白是一种由多肽链与寡糖通过共价键相连接而成的一类结合蛋白,按照其来源可分为动物源糖蛋白、植物源糖蛋白和微生物源糖蛋白,在机体内承担着结构、转运、酶促反应等重要功能[1]。食(药)用真菌中广泛存在各种类型的糖蛋白[2],且经科学研究证明具有独特的结构与功能[3];从提取制备、分离纯化与结构、功能特性及开发应用等方面加以综述,以促进对该类型糖蛋白的研究和产品开发。
食(药)用菌糖蛋白主要采用中性水溶液提取或碱性溶液(氢氧化钠)提取,2 种方法均操作简单、成本低,但相比较强碱性条件会影响糖蛋白结构和活性。使用超声、脱脂作为辅助提取手段,可提高糖蛋白得率,但也会一定程度上造成破坏性影响。
王彩丽等[4]提取香菇(Lentinus edodes)糖蛋白的最优工艺条件为85 ℃、5 h、料液比1∶15、乙醇70%(体积分数),得率为0.136%。邓春萌[5]采用响应面优化了灰树花(Grifola frondosa)粗硒糖蛋白的提取工艺,即温度为42.3 ℃、时间为7.8 h、料液比为1.0:23.9,该条件下得率为4.36%。
张鑫[6]以质量浓度为10%的氢氧化钠溶液为提取剂,在温度为80 ℃、料液比为1∶25(g·mL-1)的条件下提取60 min,猴头菇(Hericium erinaceus)蛋白多糖的得率可达53.6%。宗昱丞[7]以香菇柄为原料,采用碱液提取和酸沉淀法,获得香菇蛋白-多糖复合物PPC,测定蛋白和多糖含量分别为82.07%和12.52%(干基)。
王映斌等[8]建立了黑木耳(Auricularia auricula)糖蛋白最佳提取工艺条件,即超声功率为200 W、时间为90 min、温度为45 ℃、料液比为1∶90、pH为8.4,经分离纯化得到糖蛋白纯度为74.1%,蛋白回收率为37.5%。
程光宇等[9]以云芝(Coriolus versicolor)菌丝体为原料,分别采用水、3%草酸溶液和0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液提取蛋白多糖,以菌丝体干质量计算各方法下蛋白多糖的得率分别为2.0%、4.9%和1.9%。何卫中[10]采用先脱脂再提取香菇蛋白多糖工艺,香菇蛋白多糖的提取得率随脱脂率提高而提高,当超临界CO2萃取的脱脂率达到81.2%时,得率高达7.46%,效果显著。
综上所述,由于原料、工艺条件的差异,糖蛋白提取得率各不相同。因此,应该在充分了解糖蛋白理化性质的基础上,根据不同原料(如子实体、菌丝体、发酵液等)和不同产品的开发需求(如食品、保健品、药品等),选择合适的提取技术。
蛋白质糖基化是目前蛋白质改性中较为理想的方法,其原理是利用糖分子的羰基基团与异源蛋白的氨基基团在高温下发生共价交联反应(美拉德反应),制得糖-蛋白复合物,反应不需要催化剂[11]。该技术已成功应用于食(药)用菌多糖-蛋白复合物的制备。
齐晓彦等[12]在黑木耳多糖与乳清蛋白质量比为1∶1、反应24 h 条件下,用基于美拉德反应原理的糖基化手段制备得到能降低过敏性的多糖-乳清蛋白复合物。包怡红等[13]利用美拉德反应原理制备黑木耳多糖-大豆蛋白复合物,糖与蛋白质量比为4.18∶1.00、pH 为9.21、温度为92.88 ℃、料水比为40∶1的条件下,氨基酸的结合率达21.94%。吴怡亮等[14]也利用美拉德反应原理,首先从脱脂豆粕粉提取出大豆分离蛋白,从杏鲍菇(Pleurotus eryngii)超微粉提取出多糖,然后按1∶1 的质量比混合配制50 g·mL-1的溶液,80 ℃加热3 h,离心、冷冻干燥,获得大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物W-PP。
以食(药)用菌多糖作为糖基供体,对异源蛋白进行糖基化改性,获得的各种新型食(药)用菌糖蛋白,既是一类绿色食品添加剂,也是潜在的保健品、药品开发资源,有助于提高在食品主料、食品功能性配料和医药原料中的应用。
YANG 等[15]通过构建杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL 的cDNA 和编码序列,成功在大肠杆菌BL21 中表达了重组糖蛋白rAAL,并采用亲和层析色谱和分子筛色谱,分离获得了高纯度rAAL 和rAAL-乳糖晶体。将食(药)用菌糖蛋白基因克隆至容易培养的大肠杆菌等微生物细胞中,并得到高效表达,从而可以通过大规模高通量培养微生物,来廉价生产高纯度食(药)用菌糖蛋白,这方面国内研究很少,但前景极其广阔。
为了得到高纯度、单一组分的食(药)用菌糖蛋白,通常采用盐析、透析、离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析等方法,去除粗糖蛋白中的游离杂蛋白(肽)、游离多糖(低聚糖)和其他小分子杂质等。目前食(药)用菌糖蛋白结构分析主要包括分子量测定、蛋白含量及组成、糖含量及组成、糖苷键与糖肽键的连接方式等,但对糖蛋白高级结构、空间构象和活性位点等深层次的研究较为薄弱。已报道的相关研究涉及16 种食(药)用菌糖蛋白。
香菇子实体为材料,经热水浸提、乙醇沉淀,再经脱蛋白、脱色、DEAE-纤维素柱和纤维素凝胶柱层析分离纯化,得到Le-1、Le-2 和Le-3 三种蛋白多糖,分子质量分别为954、90、14 kDa。单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖,Le-1 中单糖摩尔比为0.39∶0.46∶1.00∶0.93∶14.13;Le-2 中单糖摩尔比为0.19∶0.41∶1.00∶0.93∶10.72;Le-3 中单糖摩尔比为0.31∶0.47∶1.00∶1.15∶8.92。Le-1、Le-2、Le-3 的葡萄糖醛酸含量分别为24.10%、3.77%和40.05%,蛋白质含量分别为2.01%、7.38%和25.31%。Le-1 和Le-2 糖苷键为α 型,Le-3 为β型。Le-3 经进一步确认其多糖与蛋白质连接为非O-糖苷键,并含有核酸RNA[16]。香菇柄经碱提酸沉得到的香菇蛋白-多糖复合物PPC,能在水溶液中形成球-链结构,且其球结构(直径为300 nm)为蛋白,而链结构(直径为50 nm)为多糖;在4.0~5.0等电点附近时,球-链结构消失,聚集成大颗粒[7]。
金针菇(Flammulina velutipes)菌丝体经热水提取和盐析、透析、柱层析纯化,得到糖蛋白FMGP,平均分子质量为348 kDa。FMGP 中蛋白质和糖的质量分数分别为79.6%和6.7%,蛋白质包括18 种氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸含量最高),糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖和一种未知的糖[17]。
黑木耳子实体提取的糖蛋白中,单糖以葡萄糖与甘露糖含量最高,分别为9.95、5.24 mg·g-1,且含有多种酸性杂多糖;氨基酸以L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸含量最高,分别为1.16、1.14 和1.10 mg·g-1,必需氨基酸种类齐全[8]。
松口蘑(Tricholoma matsutake)菌丝水提物经DEAE-sepharose 和AKAT 分离制备系统纯化,得到均一糖蛋白组分MTS03,相对分子质量为22 908.93,多糖含量为12.46%,蛋白含量为86.53%。含有O-糖肽键,糖链为α-型糖苷键连接,单糖包含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖与半乳糖(摩尔比为1.46∶2.22∶7.74∶1.29∶0.61),蛋白包含18 种氨基酸[18]。另从松口蘑菌丝体中得到胞内抗肿瘤糖蛋白,色谱柱纯化后,测得其分子质量为26 kDa,其中糖含量为12.51%,蛋白含量为87.49%;糖链包含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖与半乳糖(摩尔比为1.92∶3.38∶15.00∶2.38∶1.00),蛋白包含17 种氨基酸[19]。从松口蘑菌丝体中得到的糖蛋白MP,相对分子质量为57 000,其中蛋白含量为75.5%,多糖含量为24.5%;糖与蛋白通过O-糖肽键连接,糖链为α 型糖苷键,单糖包含葡萄糖与木糖(摩尔比为34∶1)[20]。
巴氏蘑菇(Agaricus blazei)又称姬松茸,其菌丝体经热水提取、乙醇沉淀、脱蛋白和透析,再经DEAE-纤维素和sephadex G-200 柱层析分离纯化,得到均一蛋白多糖。相对分子质量为8.6×104,蛋白含量为28.8%,糖含量为68.4%,单糖组成为葡萄糖、甘露糖和半乳糖,摩尔比为12.64∶2.16∶1.28[21]。
灰树花菌丝体经脱脂、水提和碱提,离子交换、凝胶排阻层析纯化,得到蛋白多糖GF6F2,分子质量为187 kDa,糖链部分主链为β-1,3-Glc 型、支链为β-1,6-Glc 型(比例为5∶4);蛋白由2 条游离蛋白链组成,分子质量为42.7~31.0 kDa,呈三螺旋空间构象[22]。灰树花子实体经提取、分离、精制,得到糖蛋白GFPβG,其多糖和蛋白比例为8∶2,平均相对分子质量约为1×106,多糖部分既包括以β-(1→6)结合为主链、β-(1→3)结合为侧链的葡聚糖,也包括以β-(1→3)结合为主链、β-(1→6)结合为侧链的葡聚糖[23]。虞凤慧[24]采用碱提法提取的灰树花蛋白聚糖,经Q Sepharose 离子交换层析纯化,得到组分GFPⅠ、GFPⅡ和GFPⅢ。糖含量分别为43.69%、40.88%、28.33%,蛋白含量分别为40.42%、34.65%、51.19%。均一成分GFPⅢ纯度达93.61%,分子质量为15 kDa,氨基酸总量达66.60 g·100-1·g-1,必需氨基酸总量达26.14 g·100-1·g-1,4 种呈味氨基酸总量达25.43 g·100-1·g-1。灰树花水溶性含硒糖蛋白Se-GPr,经DEAE-52 和Sephacryl S-400 纯化,获得单一组分Se-GPr11 和Se-GPr44。氨基酸种类齐全,符合理想蛋白质模式,Se-GPr11 分子质量为14.32 kDa,包含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖;Se-GPr44 由3 个分子质量分别为16.73、32.78、42.46 kDa 的亚基组成,包含甘露糖、葡萄糖和半乳糖[5]。从灰树花菌丝体中分离纯化出抗肿瘤活性糖蛋白GFG-3a,相对分子质量为88 000,糖链部分包含阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖,三维分子结构模型预测其碳端区域和氮端区域通过疏水作用连接在一起[25]。从灰树花菌丝体分离得到一种含有2 个亚基的凝集素,其相对分子质量为33 000~34 000,蛋白与多糖的比例约为3∶1[26]。
以水、酸和碱分别提取得到的云芝菌丝体粗蛋白多糖再经Sephadex G-100 柱层析纯化,水提取的蛋白质和多糖含量分别为13%和62%,酸提取的蛋白质和多糖含量分别为5%和91%,碱提取的蛋白质和多糖含量分别为5%和91%,多糖主要包含葡萄糖和木糖[9]。采用云芝菌丝体和发酵液,经热水提取、乙醇沉淀、超滤,得到淡黄灰色粉末状云芝菌丝体蛋白多糖,其糖和蛋白含量分别为62.4%与23.5%;得到橙灰色粉末状发酵液蛋白多糖,其糖和蛋白含量分别为43.8%与27.1%[27]。
从不同品种竹荪(Dictyophoraspp.)中分离得到竹荪糖蛋白。短裙竹荪(Dictyophora duplicata)菌丝体经热水提取、乙醇沉淀、DEAE-Cellulose 柱层析纯化,得到均一组分糖蛋白DdGP-3P3,分子质量为113 KDa,含16 种氨基酸,糖链部分为β-型糖苷键连接,蛋白与糖为O-型糖肽键连接,葡萄糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为2.01∶1.00∶1.23[28]。从长裙竹荪(Dictyophora indusiata)菌丝体提取的糖蛋白DiGP-2,含16 种氨基酸,半乳糖、葡萄糖、甘露糖的摩尔比为0.78∶2.13∶1.00[29]。
采用Sevage 法脱蛋白、DEAE-纤维素柱、SephadexG-100 柱层析纯化,得到松乳菇(Lactarius deliciosus)蛋白多糖的蛋白和多糖含量分别为24.53%与68.83%,单糖主要为葡萄糖、果糖和甘露糖[30]。
采用Sevage 法脱蛋白、DEAE-纤维素柱、SephadexG-100 柱层析纯化,得到红汁乳菇(Lactarius hatsudake)蛋白多糖的蛋白和多糖含量分别为15.53%与66.52%,单糖主要为葡萄糖、果糖和半乳糖[30]。
正红菇(Russula vinosa)菌丝体经磷酸缓冲液提取、硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose 离子交换和Sephadex G-100 分子筛层析纯化,得到凝集素RVL,分子质量为55.25 kDa,中性糖含量为3.87%,含有15 种氨基酸[31]。
以虎奶菇(Pleurotus tuber-regium)菌核干品为材料,经水提取、醇沉淀、Sevage 法脱蛋白、透析,得到纯蛋白多糖。其相对分子质量为39 810,氮含量为38%,糖含量为61.7%,糖链由葡萄糖、半乳糖等组成,以β-1,4 连接键为主[32]。
陈西广等[33]采用安洛小皮伞(Marasmiellus androsaceus)经水提取、sevage 法脱蛋白后获得的糖蛋白,含6.3%结合蛋白质,由15 种氨基酸组成,两条肽链与多糖的结合分别通过糖-丝氨酸苷键和糖-苏氨酸苷键。
耙齿菌(Hirschioprus abietinus-lacteus)发酵物用热水提取、乙醇沉淀、透析后,得到糖蛋白组分I1,进一步用DEAE-Sephadex A-50 和Sephadex G-150 柱纯化,得到I1-2-1 和I1-2-2 两个组分,相对分子质量分别为62 000 和9 000,含有多糖-O-丝氨酸(Glycan-O-Ser)的糖肽连接方式。分析阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比,I1-2-1 中摩尔比为1.0∶1.0∶19.2∶1.1∶1.0,I1-2-2 中摩尔比为1.0∶1.0∶8.1∶0.9∶1.1[34]。
从斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)子实体提取分离得到的凝集素,相对分子质量为35 000,糖含量为7.2%,等电点为8.15,是一种以O-型糖肽键连接的糖蛋白[35]。经纯化的斑玉蕈子实体糖蛋白HM-3A,由10 个亚基组成,每个亚基相对分子质量约为52 000,蛋白与多糖含量分别为70.2%和21.7%,含量最高的为半乳糖(达46.73%),氮端序列为-ATTQWKTSAA[36]。此外,4种水不溶性的斑玉蕈糖蛋白复合物,蛋白和多糖含量分别为7.7%~67.3%和19.8%~82.4%,单糖主要为葡萄糖[37]。
从裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)菌丝体提取分离到的糖蛋白PLG-3,蛋白和多糖含量分别为85.5%、13.7%,糖链部分包含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖[38]。
多种食(药)用菌的糖蛋白在体外试验研究阶段表现出了抗肿瘤功能。如松口蘑(松茸)菌丝体活性糖蛋白MTSGS1,体外较低剂量(20~160 mg·L-1)即能抑制海拉细胞(HeLa cell)增殖,诱导其形态异常和调亡,又能直接杀伤肿瘤细胞[39]。另有发现松口蘑的菌丝体糖蛋白MTS03 具有广谱抗瘤作用,能抑制多种来源的肿瘤细胞,而且与5-氟尿嘧啶合用时能显著增强肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[18];该糖蛋白能直接杀伤体外培养的乳腺癌细胞MCF-7,对正常肝细胞的毒性较小,是一种高效低毒的生物活性物质[40]。将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)糖蛋白POGP 分别与小鼠恶性肉瘤细胞S180 和小鼠正常细胞液混合,发现对小鼠正常细胞无作用,对S180腹水瘤细胞具有细胞毒作用,甘露糖可抑制其抗瘤活性[41]。云芝菌丝体糖蛋白PSK 是一种高度糖基化的蛋白,含相对分子质量为12 000 的功能蛋白片段,对人胃癌细胞株AGS 和肺癌细胞株A-549 等癌细胞的体外增殖具有抑制作用,抑制率达22%~84%[42]。紫芝(Ganoderma sinense)发酵液胞外多糖蛋白复合物EP1 的质量浓度为500~1 000 mg·L-1时,对肉瘤细胞具有显著抑制作用,表现为细胞密度降低和形态改变,并且这种抑制作用对剂量存在依赖性[43]。
也有许多食(药)用菌的糖蛋白在体内试验研究阶段也表现出抗肿瘤功能。如松茸菌丝体活性糖蛋白MTSGS1 的动物体内试验表明,50 mg·kg-1·d-1剂量下抑癌率达65%,脾重及脾指数增高[39]。采用松口蘑菌丝体糖蛋白进行荷小鼠恶性肉瘤细胞S180体内抗肿瘤试验表明,其对肿瘤体积生长速度具有明显抑制作用,高、中剂量组的抑瘤率均大于30%,生命延长率接近50%[44]。通过建立荷瘤小鼠模型,发现富硒蛹虫草(Cordyceps militaris)的硒蛋白多糖对小鼠的抑瘤率高达46.92%,且可提高小鼠免疫功能,抑制由环磷酰胺造成的小鼠肝脏和脾脏系数下降,增强机体抗氧化能力[45]。金针菇菌丝体糖蛋白,对荷瘤小鼠也有明显抑瘤活性,可提高网状内皮系统吞噬功能,增加小鼠体重和胸腺指数,提升小鼠脾脏淋巴细胞活性[46]。亚侧耳(Hohenbuehelia serotina)碱溶性多糖蛋白Fb 的体内试验证明,对小鼠恶性肉瘤细胞S180 和肝癌H22 细胞具有明显抑制作用,能有效降低死亡率[47]。长裙竹荪菌丝体糖蛋白DiGP-2,对小鼠恶性肉瘤细胞S180 也具有抑制作用,抑瘤率达36.82%[29]。
关于食(药)用菌糖蛋白的抗肿瘤机制,目前研究多认为与细胞S 期阻滞、白细胞介素IL(interleukin,IL)等细胞因子的分泌有关,还有报道认为与相关基因的激活有关。例如研究发现松茸菌丝体活性糖蛋白MTSGS1 是通过抑制细胞周期中S 到G2M 期的转化阶段抑制海拉细胞增殖,诱导细胞发生调亡[39]。松口蘑发酵菌丝体糖蛋白MTS03 对体外培养的乳腺癌细胞具有良好的直接杀伤作用,而对正常肝细胞的毒性较小[40]。富硒姬松茸提取物-硒蛋白多糖SPP 处理的小鼠血清,在体外可显著抑制白血病K562 细胞的生长,且具有时间依赖性,其机制可能与上调半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)基因有关[48]。纯化的金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)子实体糖蛋白PCP-3A,可通过将人白血病细胞U937阻滞在S 期而诱导其凋亡,还可通过激活人单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子来抑制U937 细胞增殖[49-50]。最新研究表明,灰树花蛋白β-葡聚糖(GFPβG)对人类乳腺癌细胞具有较好的抑制作用,其起效机制是通过激活BAK-1 基因来诱导乳腺癌细胞的凋亡[51]。
从灵芝(Ganodermaspp.)子实体水提取物中分离得到一种棕色酸性蛋白结合多糖ARBP,对Vero细胞中的单纯疱疹病毒1 型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2 型(HSV-2)均表现出强抗病毒活性,EC50分别为300 mg·L-1和440 mg·L-1。当ARBP 分别与核苷类抗病毒药阿昔洛韦、阿糖腺苷合用时,较低浓度即抑制病毒斑块形成,两药合用均具有协同效应[52]。因此,ARBP 既是一个潜在的抗病毒药,又是一个良好的联合治疗药,能减少与其合用的抗病毒药的用量,又不降低整体疗效。
来源于金针菇的蛋白聚糖PGD1-1,质量浓度为200 mg·L-1时能明显降低巨噬细胞的一氧化氮和活性氧的生成,同时还可上调白细胞介素-10(IL-10),下调TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的分泌,从而有效抑制脂多糖诱导的巨噬细胞共培养模型炎症反应[53]。该研究发现为糖蛋白抑制炎性功能食品的开发,提供了理论依据。
紫芝胞外多糖蛋白复合物EP1 具有清除羟自由基的能力,且随着质量浓度的增加而增强。当EP1质量浓度为3.33 g·L-1时羟自由基清除率可达72.59%,IC50为1.93 g·L-1[43]。采用聚能超声波辅助盐提取的绣球菌糖蛋白,具有清除DPPH·、O2-·、OH·、H2O2·和ABTS·的作用,且清除率随糖蛋白质量浓度的增加而提高,IC50分别为6.405、4.418、1.440、4.429 和0.522 g·L-1[54]。由此可见,食(药)用菌糖蛋白主要通过清除自由基表现出抗氧化能力,因而成为开发高效无毒天然抗氧化产品的理想资源,未来将在机体疾病预防和治疗中扮演重要角色。
灵芝中分离出的糖蛋白F3 能够刺激脾细胞增殖,改变细胞免疫表现型的表达,其多糖结构中α-(1→2)链接的果糖残基是直接影响免疫活性的主要因素[55]。灰树花蛋白β-葡聚糖GFPβG 依靠关键结构β-葡聚糖来发挥免疫活性调节作用,包括通过促进有丝分裂和激活免疫效应细胞(如淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞),来刺激各种细胞因子和趋化因子的产生,如白细胞介素(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素(IFN-γ)等[56]。以上研究结果提示,食(药)用菌糖蛋白也许主要依靠其糖链部分发挥免疫调节作用,而蛋白部分所起的作用还有待进一步研究。
研究表明,食(药)用菌糖蛋白的免疫调节作用与其刺激巨噬细胞释放各种免疫因子紧密关联。例如在4 种水不溶性斑玉蕈糖蛋白复合物中,碱溶性糖蛋白复合物F1 和酸溶性糖蛋白复合物F2 能够显著刺激巨噬细胞释放一氧化氮、前列腺素和其他细胞因子[37]。当大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物的质量浓度达到100 mg·L-1时,能够提高巨噬细胞中性红吞噬活性和一氧化氮释放量,并能提高TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量及mRNA 表达水平,表明该糖蛋白能明显提升小鼠巨噬细胞系的免疫调节能力,且存在剂量依赖效应[14]。
此外,食(药)用菌糖蛋白的免疫调节作用还与细胞免疫应答有关,例如从香菇菌丝体提取得到分子质量为500 kDa 的蛋白-多糖复合物,能够介导人外周血单个核细胞的免疫应答[56]。目前食(药)用菌糖蛋白被普遍当作非特异性免疫增强剂和免疫效应剂,临床疗效确切,国际上称为生物反应调节剂(BRM),未来在医疗和食品领域用途广泛[57]。
以3 个剂量组(10、20、50 mg·kg-1·d-1)的香菇蛋白多糖连续灌胃小鼠7 d,表现出其抗疲劳作用,其中20 mg·kg-1·d-1为最佳剂量。香菇蛋白多糖明显提高了游泳小鼠体内肌糖原和肝糖原储备量,提高了运动前后乳酸脱氢酶活力,降低了运动后血尿素氮增量,加速了体内尿素氮清除速率[58]。
灵芝蛋白多糖FYGL 具有降糖作用[59]。机制研究表明灵芝蛋白多糖可以抑制大鼠胰岛细胞瘤细胞(INS-1)和相关信号通路途径,上调抗凋亡基因bcl-2的表达,从而达到了抑制β 胰岛细胞凋亡、改善胰岛功能的作用[60]。
经灰树花蛋白β-葡聚糖GFPβG 处理后的动物在行为试验中具有快速和较强的抗抑郁效果,且这种抗抑郁效果不同于神经兴奋性药物,其机制是GFPβG 通过增强小鼠大脑前额叶组织中磷酸化谷氨酸受体1(p-GluA1)及其亚基(谷氨酸受体Glu-A1、GluA2 和GluA3)的表达水平,来增强α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体功能,AMPA 受体负责介导中枢神经系统的兴奋性传递,其功能的增强有利于发挥抗抑郁作用[61]。深入研究表明,GFPβG 是通过激活小鼠中枢神经系统受体Dectin-1 来增强神经突触兴奋性而产生抗抑郁作用的[62]。这些发现将有助于未来开发出起效快、作用时间长、副作用小、安全的新型抗抑郁药物。
采用水提醇沉法得到的杏鲍菇、口蘑(Tricholoma mongolicum)、海鲜菇(斑玉蕈)、平菇(糙皮侧耳)、香菇等多种真菌糖蛋白,在质量浓度为12.5~50.0 mg·L-1时,对因顺铂诱导受损的肾细胞均具有一定恢复作用,能有效降低化疗药物顺铂的肾毒性[2]。该研究预示食(药)用菌糖蛋白未来也许可作为化疗药物的辅助治疗手段,但其降低化疗药物毒性的机制还有待深入研究。
灰树花水溶性含硒糖蛋白Se-GPr11 和Se-GPr44,能通过促进超氧化物歧化酶活性、抑制丙二醛水平和活性氧产生量,来拮抗砷的免疫毒性作用;还能通过作用于丝裂原活化蛋白激酶通路,下调磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)和磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38 抗体(p-P38)的蛋白表达,促进IL-2 和IFN-γ 分泌,来干预砷致巨噬细胞免疫毒性产生[5]。
小鼠醋酸扭体抑制试验中发现,不同提取分离方法得到的多种安络小皮伞糖蛋白均具有镇痛作用,且未见有明显的活性差异,这种镇痛作用来自于这些糖蛋白的共同结构部分[63]。
不同原料、不同工艺制备的食(药)用菌糖蛋白表现出不同的理化性质。例如采用DEAEsepharose 和AKAT 快速分离制备系统,可得到的松口蘑菌丝体糖蛋白MTS03。其冻干样品为白色絮状物质,易溶于水,不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂,具有热不稳定性,常温下稳定,但温度超过56 ℃时会随时间延长逐渐失去活性,此特性显然不适合后续的产品加工[18]。采用聚能超声波辅助盐法提取的绣球菌(Sparassis crispa)糖蛋白,随着浓度增加,其持油性、持水性、起泡和乳化稳定性逐渐增大。起泡性先增大后减小,乳化性先增大后减小再增大。这说明该糖蛋白具有良好的食品加工特性,可以作为食品配料或功能性食品原料[54]。
值得注意的是采用异源蛋白糖基化技术制备的食(药)用菌多糖-蛋白复合物往往表现出优异的食品加工特性。例如黑木耳多糖-乳清蛋白复合物,能有效降低乳清蛋白抗原性(α-乳白蛋白降低75.7%,β-乳球蛋白抗原性降低25%)[12]。黑木耳多糖-大豆分离蛋白复合物的乳化活性与稳定性分别比大豆蛋白提高18.46%和10.33%,溶解性和热稳定性也有所提高[13]。大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物WPP 也具有较强乳化性、溶解性和热稳定性等[14]。
4.2.1 食品应用
相比于食(药)用菌糖蛋白的纯化和功能研究,其食品应用方面的报道较少,预计随着未来各种新型功能食品、特医食品的兴起,这方面的研究将越来越多。已有报道如香菇蛋白-多糖复合物PPC,具有依次排列的疏水蛋白和亲水多糖结构,表现出极佳的油水界面迁移和固化能力,利用此优越性能开发出稳定的高内相乳液(HIPEs)运载体系,进行β-胡萝卜素的包埋,可使β-胡萝卜素留存率提高,取得优良的保护效果[7]。
4.2.2 农业应用
食(药)用菌糖蛋白作为绿色生物农药,在植物抗病毒方面的应用,国内起步较早并已有报道。例如香菇菌固体发酵木屑、麦麸后的培养物,经热水提取、浓缩,制得1%菇类蛋白多糖水剂,毒理学试验和田间试验表明对番茄病毒病有良好的防治效果[64]。采用真菌发酵提取物制得的0.5%菌类蛋白多糖水剂,经田间试验表明对水稻条纹叶枯病有较好的防治效果,用量为4.69~5.63 g·h-1·m-2,使用后对人畜无毒副作用、对植物无残留、对环境无污染[65]。同样的0.5%菇类蛋白多糖水剂,加水稀释300~500倍后,对大田烟草、番茄和黄瓜的病毒病的防效达65%以上,并能改善上述作物的性状[66]。菌类蛋白多糖制剂能够作为预防性抗病毒生物制剂,是因为其含有的蛋白多糖成分能够通过诱导并增强植物免疫力,来抑制病毒侵染及在寄主中的繁殖,从而达到抗病毒和增产的目的[66]。
4.2.3 产品开发
猴头菇蛋白多糖口含片,配方为猴头菇蛋白多糖0.1 g、柠檬酸0.02 g、木糖醇0.1 g、淀粉0.16 g 填充,规格为0.38 g/片,总抗氧化能力强,产品酸甜可口,可操作性强[6]。双孢蘑菇(Agaricus bisporus)蛋白多糖片分别按剂量0.33、0.66、1.33 g·kg-1连续饲喂大鼠30 d,未见明显中毒体征,也未见死亡,体重、饲料利用率、血生化指标、血常规指标和脏体比均无统计学差异,未见组织病理学异常,说明该产品在试验剂量下无明显的亚急性毒性[67]。采用从双孢蘑菇提取出来的菇精蛋白多糖片,饲喂四氯化碳所致急性肝损伤的小鼠30 d,能抑制血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高,减轻肝组织的病理损伤,起到保护肝脏作用[68]。
在当前国家大食物观、大健康战略指引下,从微生物途径要热量、要蛋白越来越受到重视,加强食(药)用菌糖蛋白产品开发,符合人民群众对美好生活质量的需求。食(药)用菌糖蛋白的研究报道虽然在不断增加,但近五年的进展趋势缓慢。为了更好地加快食(药)用菌糖蛋白研究和产品开发速度,未来亟需解决以下一些关键问题。
优化食(药)用菌糖蛋白提取技术的目的是,在保持蛋白活性前提下尽可能地获取较高的得率,因此,无损提取技术提取有待进一步试验。例如,无损高效破壁释放技术,包括低温微纳米破壁、高压匀浆破壁、高速珠磨破壁、低温风洞破壁等;无损干制技术,包括冷冻喷雾干燥、低温静电干燥等。此外,为了降低成本,建议以来源丰富、价格便宜的食(药)用菌下脚料(如残次菇、菇脚和菌糠等)为材料,开展糖蛋白提取工艺研究。
盐析、透析、离子交换层析、凝胶层析等分离纯化技术,由于操作难度大、成本高,只能用于实验室少量制备,无法应用于工业化大规模生产。鉴于此,应多从浓缩、富集的角度考虑糖蛋白的提纯,这方面采用现代新材料的膜技术及设备大有用武之地,可以通过设计特定的膜孔径,来截留已知分子质量的糖蛋白,从而获得高浓度、高含量的糖蛋白制品,用于后续的产品生产。
采用质谱、核磁、芯片和生物信息学技术等,重点加强食(药)用菌糖蛋白生物活性与其构效关系的研究。例如,糖链和肽链的空间构象、活性中心、活性位点、糖基化连接位点、肽修饰位点,肽载体、单糖与氨基酸序列,糖苷键与糖肽键相关性分析表征等。从而进一步明确功能机制,并发现更多的新结构和新功能。
充分依托我国丰富的食(药)用菌资源,开发多品种的食(药)用菌糖蛋白产品。剂型除了胶囊、口服液外,还可选择中药制剂技术,如冲剂、汤剂、煎剂、膏剂、丸剂、粉剂、泡剂等。提倡基于现代中西医学理论和营养学理论,开展配伍配方研究,研发复方制剂产品。
对功能突出的食(药)用菌糖蛋白,应重点加强其生物合成机制研究,明晰其代谢途径、基因编码序列及调控方式,在此基础上开展糖蛋白基因克隆与高效表达研究,构建糖蛋白高产工程菌。
凝集素是一种能凝集细胞、特异性结合碳水化合物的蛋白质或糖蛋白,食(药)用菌中含有多种类型的凝集素[69]。目前对食(药)用菌凝集素的糖结构研究较少,通过对已发现的食(药)用菌凝集素开展进一步的分析研究,确定其糖蛋白结构,将极大地拓展对食(药)用菌糖蛋白的认知。