基于网络药理学方法分析柴胡配伍香附治疗癫痫的作用机制∗

吕婷婷，蓝绍航，李瑞暖，秦红玲，刁丽梅△

1 广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530000； 2 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530000

癫痫是以脑神经元异常放电为特征的慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征［1］。目前全球约有7千万癫痫患者，我国癫痫患病率约为3.6‰～7.0‰，活动性癫痫患者数量达900 多万，而且每年以40 万的数量递增［2］。癫痫反复发作，治疗时间长，不仅给患者身体、心理带来伤害，也给患者家庭增加了经济负担，给社会、国家追求国民健康的目标带来了更大挑战［3］。因此，研究癫痫的有效治疗方法成为目前亟需解决的医学和社会任务。

柴胡归肝、胆经，善于疏肝解郁；香附归肝、脾、三焦经，善于理气疏肝，香附能助柴胡解肝经之郁滞，促进柴胡行气活血之效。柴胡、香附常用于治疗癫痫，但两者的化学成分较多，而且两者治疗癫痫的分子机制尚不明确，因此，本研究采用网络药理学方法，分析柴胡配伍香附治疗癫痫的潜在作用机制，为后期研发及治疗癫痫提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 柴胡、香附有效成分及作用靶点中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是独特的中草药系统药理平台，其由在《中华人民共和国药典》中注册的499 味中草药组成，包含29384 个成分、3311 个靶标和837种相关疾病，是针对每个化合物成分提供较为全面的人体吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程的评估数据，通过该数据库可获取药物、靶标和疾病之间的关系。通过TCMSP 数据库（http：//Tcmspw.com/tcmsp.php）检索“柴胡、香附”，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）表示口服剂量未改变药物到达体循环的百分比，药物相似性（drug-likeness，DL）是药物设计中使用的一个定性概念，用于评估化合物的“药物样”程度，这有助于优化药代动力学和药物特性，因而设置满足条件：OB＞30%，DL＞0.18，下载符合条件的有效成分，同时查找有效成分靶点，将无ADME信息的化合物从最终名单中删除。最后通过Uniprot 数据库（http：//www.pharmgb.org/）将预测出的靶点蛋白名转换为基因名。

1.2 疾病相关基因筛选人类基因数据库（the human gene database，GeneCards）是人类基因综合数据库，可提供简明基因组、蛋白质组、遗传和功能方面已知和预测的人类基因。利用GeneCards数据库（http：//www.Genecards.org/）、在线孟德尔人类遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//www.OMIM.org/）筛选“seizure disorder”基因，以获得相对完善的基因数据。

1.3 筛选靶基因使用R语言软件“VennDiagram”包，将癫痫相关基因分别与柴胡、香附作用靶点取交集，获得柴胡、香附作用于癫痫的靶基因，并绘制韦恩图。

1.4 中药有效成分与靶基因的关系通过自编程的Perl 脚本选出与靶基因相关的有效成分，同时利用Cytoscape 软件构建柴胡、香附有效成分与癫痫靶基因关系图。

1.5 关键基因的蛋白-蛋白相互作用网络(proteinprotein interactions，PPl)STRING数据库是一个可以检索已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的数据库，为了更好体现靶基因表达蛋白间的关系，通过STRING 数据库在满足综合得分≥0.4的条件下建立PPI网络。

1.6 基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）采用GO 和途径富集分析靶基因，可揭示其所参与的细胞成分、分子功能、生物过程及信号通路，便于理解中药有效成分作用于疾病的潜在机制。Bioconductor 是一个基于R语言的、面向基因组信息分析的应用软件集合，可运用于DNA 微阵列或基因芯片数据处理、分析、注释等。利用Bioconductor 中的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”3 个功能对靶基因进行GO 和KEGG富集分析，GO分析包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(cellular component，CC)。

2 结果

2.1 柴胡、香附有效成分及其作用靶点在TCMSP数据库中筛选出柴胡有效成分179个，作用靶点1704 个，香附有效成分104 个，作用靶点689个，通过自编程的Perl 脚本将作用靶点转换为基因文本，获得柴胡677 个有效、独立的靶基因，香附289个有效、独立的靶基因。

2.2 疾病相关基因与靶基因共获得10293个与癫痫相关、独立有效的基因。利用R 语言软件“VennDiagram”包将10293 个与癫痫相关的基因分别与677个柴胡作用靶点、289个香附作用靶点取交集，共获得39 个靶基因，即为柴胡配伍香附治疗癫痫的靶基因，见表1及图1。

图1 癫痫与柴胡、香附作用靶点的交集

表1 靶基因的重要通路

2.3 有效成分与靶基因关系网络图有效成分-靶基因关系网络见图2。

图2 柴胡-香附的“成分-核心靶点-通路”网络模型

2.4 靶基因PPl网络共筛选出ESR1、AR、NCOA1、NCOA2、NR3C1等30个重要靶基因，即为柴胡配伍香附治疗癫痫的重要作用靶点，见图3—4。

图3 柴胡配伍香附治疗癫痫的靶基因PPI网络

图4 关系较为密切的前30个靶基因

2.5 GO 和KEGG 富集分析靶基因的GO 功能主要涉及细胞因子受体结合、DNA 结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异等；KEGG 信号通路主要富集在神经活性配体-受体相互作用、雌激素信号通路、胆碱能突触、乳腺癌、前列腺癌，通路上CHRM2、GABRA1、PRSS1、CHRM3、CHRM1、ADRA1A、NR3C1、CHRNA2、GRIA2、ADRA2C、TRPV1、CHRM4等相关基因较为重要。见图5—6。

图5 GO富集分析

图6 KEGG富集分析

3 讨论

癫痫主要是由大脑神经反复、过度同步化放电导致发作性、突然短暂性的脑功能失调、紊乱［4］，是一种毁灭性的神经疾病，发病率、致残率和死亡率较高［5］。目前西医治疗癫痫主要包括药物治疗、手术治疗等，但存在药物副作用大、术后复发率高等缺点；中医治疗癫痫历史悠久、经验独特。本研究通过探讨柴胡配伍香附治疗癫痫的有效靶点和信号通路，为中医药治疗癫痫提供新思路。根据癫痫发作的临床特征，将其归于中医“痫证”范畴，研究治疗癫痫的方剂发现柴胡和香附配伍能够有效治疗癫痫发作。

中医称“癫痫”为羊癫疯，羊角风，最早可追溯到《黄帝内经》，该书提出了“胎儿病”和“癫痫”的名称，其中《素问•奇病论篇》载：“人生而有病癫疾者……病名为胎病此得之在母胎中时，其母有所大惊，气上而不下，精气并居，故令子发病发为癫疾也”，可知癫痫的发生与先天因素有关；《丹溪心法》载“无非痰涎壅塞，迷闷孔窍”，可知痫证与痰密切相关。有文献认为癫痫因痰作祟，并自拟方加减顺气导痰汤治疗癫痫，显示治疗有效［6］。同样也有文献认为癫痫发作常见痰火内闭，使用清阳痫速康胶囊有效率达89%［7］。

香附、柴胡配伍来源于柴胡疏肝散，出自《医学统旨》，具有疏肝理气和活血止痛功效，主治胁肋疼痛、胸闷善太息、情志抑郁易怒、或嗳气、脘腹胀满、脉弦。柴胡善疏肝解郁为君，香附理气疏肝而止痛，两者配伍可解肝经之郁滞，共奏疏肝行气、活血止痛之功，符合痫证病机，临床治疗痫证疗效明确，但具体机制仍需更多研究挖掘。文献报道柴胡加龙骨牡蛎汤加减可减少颞叶癫痫发作时间，减少发作次数，改善患者睡眠质量［8］。陈士铎《本草新编》中提及：香附，味苦而甘，气寒而浓，阳中阴也，无毒；入肝、胆之经；专解气郁气疼，调经逐瘀，皮肤瘙痒，止霍乱吐逆，崩漏下血，乳肿痈疮；宿食能消，泄泻能固，长头发，引血至气分，乃气血必用之品；香附源于莎草科植物莎草的根茎，味辛、微苦、甘，性平，能疏肝理气、调经止痛［9］。

本研究共筛选出283 个候选化合物，其中柴胡179 个化学成分，香附104 个，成分-靶点PPI 网络有204 个节点，1184 条连接，靶基因30 个，同时通过GO 富集分析和基因KEGG 通路，筛选出GABRA1、GRIA2、TRPV1、GSK3B 4 个与癫痫相关的核心基因，筛选出5 条与癫痫相关的通路，分别为：神经活性配体-受体相互作用、雌激素信号通路、胆碱能突触、乳腺癌、前列腺癌。

北京大学第一医院学者通过11 例癫痫患者基因测序发现，在GABRA1 基因变异相关的癫痫中，全新致病变异较遗传变异更常见，由GABRA1基因变异引起的癫痫大多发生在婴儿期，且多数患者多次癫痫发作预后较好，但仍可能存在不同程度的发育迟缓［10］。有研究团队通过家系全基因组检测发现，癫痫患者中GRIA2 基因c.2375G＞T（p.Gly792Val）新生错义变异，与神经发育障碍伴语言障碍及行为异常相关［11］。研究者回顾了有关靶向TRPV1 的新型分子专利文献，发现抑制海马中的TRPV1 可能是预防癫痫发作的新靶标，最重要的是它可以作为癫痫治疗未来临床评估的候选药物［12］。研究者使用小鼠毛果芸香碱癫痫模型发现，癫痫小鼠海马结构中的糖原合酶激酶3β（Gsk3b）mRNA水平降低［13］。

学者研究发现去除卵巢的雌性大鼠的雌二醇对诱导的癫痫状态大鼠海马神经具有保护作用［14］。研究结果表明，抗癫痫药物可以调节海马体中雄激素和雌激素通路，从而导致颞叶癫痫患者精神和生殖障碍［15］。通过动物实验，研究学者发现G 蛋白偶联雌激素受体1 通过改变大脑氧化或者抗氧化参数来介导雌激素信号通路，从而导致戊四氮诱导的大鼠癫痫发作和脑组织氧化损伤［16］。在癫痫活跃的人类大脑皮层中，乙酰胆碱分解代谢酶乙酰胆碱酯酶的活性升高，也发现乙酰胆碱合成酶胆碱乙酰转移酶的活性在癫痫患者的皮质中被检测到。另外也有毒蕈碱激动剂毛果芸香碱和槟榔碱能降低电击诱发癫痫发作的阈值，并且乙酰胆碱酯酶抑制剂能增加啮齿动物对化学性惊厥的易感性［17］。乳腺癌耐药蛋白是一种依赖三磷酸腺苷的外排转运蛋白，与癫痫和癌症的多药耐药现象有关，是药物相互作用的潜在来源［18］。

本文通过网络药理学方法对柴胡配伍香附治疗癫痫作用机制进行初步探讨，推测其可能的作用通路，阐述柴胡配伍香附产生抗癫痫作用的机理。本研究发现柴胡配伍香附治疗癫痫主要机制与雌激素信号通路、胆碱能突触、乳腺癌3 个通路相关，但该结果尚需要后续研究进行验证。