山柰酚体外促成骨分化作用研究

王文丽 李金诺 刘 阳 李友瑞

滨州医学院附属医院口腔修复科，山东滨州 256603

牙列缺损和牙列缺失是口腔临床中常见的疾病，随着临床治疗技术及生物材料应用的发展，种植义齿已成为诸多缺牙患者首选的修复方式。植入位点充足的牙槽骨量是实现种植体骨结合、保证种植修复远期疗效的先决条件[1]。然而，临床患者的缺牙区常伴有因外伤、根尖周炎、牙周炎等原因导致的骨缺损[2-3]。山柰酚是一种黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜、水果和草本植物中，如甘蓝、山楂和山柰等，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、神经保护以及预防骨质疏松等功效[4]。近年来，山柰酚在防癌抗癌、预防骨质疏松等方面的研究较多，但在口腔领域中的应用研究较少。基于此，本研究通过体外细胞实验探讨不同浓度的山柰酚对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖和成骨分化的影响，以期为种植体周围骨缺损的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

BMSCs 购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。山柰酚、DMEM 培养基、青链霉素购于美国Sigma 公司；胎牛血清购于澳洲Clark 公司；CCK8 试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒、茜素红染色试剂盒及实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 山柰酚溶液配制

用电子天平称量0.57 mg 山柰酚，溶解于10 μl的二甲基亚砜中，将完全溶解的山柰酚溶液移至50 ml离心管内，加入20 ml 的完全培养基混匀，配制成含有10-4mol/L 山柰酚的完全培养基，将其过滤除菌作为母液。其后分别取10-4mol/L 山柰酚母液加入一定量的完全培养基依次稀释至10-5、10-6、10-7、10-8mol/L，避光放置4℃保存。

1.3 CCK8检测细胞增殖

将BMSCs 以5000 个/孔接种于96 孔板，培养24 h 后 分 别 加 入 浓 度 为0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L 山柰酚的完全培养基，培养1、4、7 d 后，每孔加入100 μl CCK8 工作液，放入培养箱中孵育1 h，置于酶标仪内检测450 nm 波长下的光密度（optical density，OD）值，测得不同浓度山柰酚对BMSCs 增殖的影响。

1.4 碱性磷酸酶活性检测

将BMSCs 以104个/ 孔 接 种 于24 孔 板，培养24 h 后，更换含不同浓度山柰酚的成骨诱导液（DMEM 培养基+10% 胎 牛 血 清+1% 青链霉素+1 mmol/L β-甘油磷酸钠+5 μmol/L 维生素C+100 nmol/L 地塞米松）。结合CCK8 实验结果，共设4 个分组，实验组分别加入1 ml 含10-8、10-7、10-6mol/L 山柰酚的成骨诱导液，对照组加入等量不含山柰酚的成骨诱导液。分别培养4、7、14 d 后，按试剂盒要求操作，于酶标仪中检测405 nm 下的OD值，根据公式，计算每个样品的碱性磷酸酶活性。

1.5 茜素红染色

细胞培养与分组同1.4，钙化诱导14 d 后，弃旧培养基，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定30 min 后，加入PBS 冲洗3 次，每孔加入1 ml 0.1%的茜素红染色30 min，染色完成后吸弃茜素红染液，PBS 充分冲洗，倒置显微镜下观察拍照。

1.6 RT-qPCR

细胞培养与分组同1.4，钙化诱导7 d 后，使用trizol 法提取RNA，并将其反转录为cDNA。其后取2 μl cDNA 进行PCR，PCR 引物序列见表1，反应条件为：95℃、30 s，1 个循环；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40 个循环。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（± s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，LSD-t检验进行两两比较，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度山柰酚对BMSCs增殖的影响

CCK8 实验结果如图1 所示，1 d 时，10-4mol/L山柰酚组的OD 值小于0 mol/L 山柰酚组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），对BMSCs 细胞增殖有抑制作用；10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 山柰酚组 的OD 值与0 mol/L 山柰酚组差异无统计学意义（P＞ 0.05），对BMSCs 增殖无明显影响。4、7 d 时，10-4mol/L 山柰酚组OD 值仍明显小于0 mol/L 山柰酚组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；10-8、10-5mol/L 山柰酚组的OD 值与0 mol/L 山柰酚组差异无统计学意义（P＞ 0.05）；10-7、10-6mol/L 山柰酚组的OD 值大于0 mol/L 山柰酚组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。结果表明，10-4mol/L 山柰酚明显抑制BMSCs 增殖，10-7、10-6mol/L 山柰酚具有促进BMSCs 增殖的作用，且以10-6mol/L 山柰酚促进作用最明显。

图1 BMSCs 在不同浓度山柰酚培养基中的增殖情况

2.2 不同浓度山柰酚对BMSCs 碱性磷酸酶活性的影响

碱性磷酸酶活性检测结果如图2 所示，4 d 时，各组间的碱性磷酸酶表达差异无统计学意义（P＞ 0.05）。7 d 和14 d 时，10-8mol/L 和10-7mol/L 山柰酚组的碱性磷酸酶表达水平与0 mol/L 山柰酚组差异无统计学意义（P＞ 0.05）；10-6mol/L 山柰酚组的碱性磷酸酶表达水平明显高于0 mol/L 山柰酚组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。结果表明，10-6mol/L 山柰酚对BMSCs 的碱性磷酸酶活性有明显促进作用。

图2 不同浓度的山柰酚对BMSCs 碱性磷酸酶活性的影响

2.3 不同浓度山柰酚对BMSCs 成骨矿化的影响

按照实验分组矿化诱导BMSCs 14 d 后，茜素红染色结果如图3 所示，a、b、c、d 分别为0、10-8、10-7、10-6mol/L 山柰酚组。四组均可见不同程度的矿化结节形成，其中10-6mol/L 山柰酚组形成大面积深染的钙化结节；与之相比，0、10-8、10-7mol/L 山柰酚组的钙化结节数量较少。

图3 倒置显微镜观察茜素红染色结果（40×）

2.4 不同浓度山柰酚对BMSCs成骨基因表达的影响

RT-qPCR 结果显示，诱导培养7 d 时，与0 mol/L 山柰酚组相比，10-8mol/L 和10-7mol/L 山柰酚组Runx2 mRNA 的表达差异无统计学意义（P＞ 0.05）；10-6mol/L 山柰酚组Runx2 mRNA 的表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图4。此外，与0 mol/L山柰酚组相比，10-8mol/L和10-7mol/L山柰酚组OCN mRNA的表达差异无统计学意义（P＞ 0.05）；10-6mol/L 山柰酚组OCN mRNA 的表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图5。

图4 不同浓度的山柰酚对Runx2 mRNA 表达的影响

图5 不同浓度的山柰酚对OCN mRNA 表达的影响

3 讨论

在口腔种植修复中，植入位点常伴有因外伤、牙周炎等原因导致的骨缺损，传统的自体骨移植和同种异体骨移植是临床中骨缺损修复的常用方法[5-6]。然而，这些方法存在供骨量有限、需开辟第二术区及免疫原性问题[7]。近年来，基于天然产物的药物被认为是预防和治疗临床疾病的新治疗策略[8]，其中黄酮类化合物的研究最为广泛[9-10]。山柰酚是一种黄酮类化合物，其具有多种功效，被认为是重要的天然抗炎化合物之一。Devi 等[11]研究表明，山柰酚可以通过调节炎症相关基因的表达、抑制促炎细胞因子以及调控细胞黏附分子等途径起到良好的抗炎效果。此外，山柰酚还可有效预防女性更年期骨质疏松。Prouillet 等[12]研究表明，山柰酚通过调节细胞外调节蛋白激酶和雌激素受体的途径，增加MG-63 成骨样细胞中碱性磷酸酶活性。Sharma等[13]研究发现山柰酚可通过上调小鼠胫骨骨缺损模型中Runx2 和β-catenin 基因的表达，并通过激活Wnt/β-catenin 信号通路促进人成骨肉瘤细胞的成骨向分化。

本研究使用不同浓度的山柰酚处理BMSCs，观察细胞增殖、矿化及成骨相关基因表达情况。CCK8结果显示，10-4mol/L 山柰酚对BMSCs 干预1 d 后，便对细胞增殖起到明显的抑制作用，该结果与大量研究所表明的高浓度山柰酚具有细胞毒性[14-15]的结果相一致；10-8、10-5mol/L 山柰酚对BMSCs 增殖无明显作用，10-7、10-6mol/L 山柰酚对BMSCs 增殖有明显促进作用，其中以10-6mol/L 促进作用更明显。碱性磷酸酶活性检测结果显示，10-8、10-7mol/L 山柰酚对BMSCs 的碱性磷酸酶表达无影响，10-6mol/L山柰酚可使BMSCs 的碱性磷酸酶表达升高，表明10-6mol/L 山柰酚可促进BMSCs 早期的成骨分化。茜素红染色结果显示，在10-6mol/L 山柰酚的作用下，细胞形成的钙化结节较大，且颜色深、数量多，该结果更加直观地表明10-6mol/L 山柰酚可促进BMSCs 的成骨矿化。此外，RT-qPCR 结果显示，10-8、10-7mol/L 山柰酚对BMSCs 的Runx2、OCN mRNA 的表达无明显作用，10-6mol/L 山柰酚可促进Runx2、OCN mRNA的表达，进一步证实了10-6mol/L 山柰酚对BMSCs成骨矿化的促进作用。

综上所述，10-6mol/L 山柰酚可促进BMSCs 增殖及成骨向分化，这可能为山柰酚应用于种植体周围骨缺损的修复治疗提供一定理论依据。此外，关于山柰酚促进BMSCs 成骨分化的作用机制以及相关动物实验有待后续进一步研究。