苗药“杆努尽烟”对慢性支气管炎大鼠肺组织AP-1因子表达的影响

刘彦吉 蒙光敏 李贵雪 吴 宁 吴遵秋

贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳 550025

慢性支气管炎（chronic bronchitis，CB）又称慢支，是气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，可定义为在2 年内发生持续超过3 个月的慢性咳嗽咳痰。CB 与吸烟具有很强的因果关系，常可进展为慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心脏病等严重隐患，引发国内外学者的关注[1-2]。贵州省少数民族苗药“杆努尽烟”（学名吊石苣苔，Lysionotus pauciflorus）常被当地用于治疗支气管炎、肺结核等多种疾病，疗效显著[3-4]，前期科研工作已证实苗药“杆努尽烟”对CB 大鼠的抗感染治疗有一定效果，但作用机制尚不明确[5-7]。研究发现激活蛋白-1（activating protein-1，AP-1）作为包含c-jun、c-fos 亚基的异二聚体复合物，与炎症性疾病的发病进展有密切关系，是多种疾病的主要靶点[8-10]。当机体受到某些刺激后，可诱导AP-1活化，活化的AP-1 还能促进多种炎症因子、趋化因子的表达，影响炎症的发生进展。故本研究通过探究“杆努尽烟”对CB 大鼠抗炎机制及其对AP-1 表达的影响，为苗药的药物作用的分子机制的研究提供依据，为后续药物开发提供实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和药物 50 只SD 大鼠，体重（200±20）g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，动物合格证号：[SYXF（黔）2018-0001]，本研究经实验动物伦理委员会审批（审批号：200074）。“杆努尽烟”全草于2014 年6 月采于自我国贵州省凯里市炉山镇，经贵州中医药大学潘炉台博士鉴定为苦苣苔科（Gesneriaceae）。

1.1.2 药品、试剂及仪器 遵义牌香烟，桂龙咳喘宁[ 桂龙药业（安徽）有限公司，国药准字 Z20053135，规 格：0.5 g×27 粒/ 盒]，脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS，美国Sigma），c-jun 抗体（杭州华安生物技术有限公司），c-fos 抗体（南京巴傲得生物科技有限公司），c-jun、c-fos 引物（武汉天一辉远生物科技有限公司），DNA Ladder（南京诺唯赞生物科技有限公司），DAB 试剂盒（武汉博士德），生物素抗人IL-8 抗体工作液（上海泛柯实业有限公司）、4℃低温高速离心机（美国Thermo），BX51TPHD-J11 型显微镜（日本奥林巴斯），Synergy H1 全功能酶标仪（美国伯腾BioTek），B-500 超微量紫外可见分光光度计（上海元析）等。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 取“杆努尽烟”干样，使用蒸馏水完全浸泡，后置于90℃恒温水浴箱中连续浸提，待过滤后收集浸提液，再将药物浓缩配制浓度2.5 kg/L（按生药量计），灭菌后放入4℃冰箱储存。

1.2.2 实验分组 将50 只大鼠适应性喂养1 周后，按照随机数表法分成5 组：空白对照组、实验组（模型组、阳性对照组、“杆努尽烟”高剂量组、“杆努尽烟”低剂量组），每组各10 只。于造模第1、14 天予实验组各组大鼠LPS 气管内滴注处理，其余组每日烟熏2 次，每次30 min（4 支遵义牌香烟/箱）。造模检验成功后第2 日进行灌胃给药干预，连续灌胃28 d，1 次/d。28 d 后将各组大鼠处死，解剖提取其肺组织进行后续实验。见表1。

表1 各组大鼠分组情况

1.2.3 测定指标 取大鼠肺组织，HE 染色，光镜下观察病理形态；酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定肺组织肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）水平；蛋白免疫印迹（western-blot）检测c-jun、c-fos 含量，实时荧光定量PCR 检测c-jun、c-fos mRNA 表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计学软件分析数据，对各种数据分析实行分级管理。对所有资料都采用正态性和方差齐性检验，计量资料用均数±标准差（± s）表示，对满足正态性分布且方差齐的多组计算均数间比较用单因素方差分析，当方差不齐时，则用非参数秩和检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。P＜ 0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠HE染色结果比较

给药后肺组织HE 染色。空白对照组：肺脏层胸膜结构正常；肺泡上皮细胞结构正常，未见明显改变，见图1A。模型组：各级支气管周围和肺泡上皮细胞、肺间质均可见大量的炎症细胞巨噬细胞、淋巴细胞浸润，大量纤维组织增生，在局部肺泡上皮细胞产生炎症坏死病灶，见图1B。“杆努尽烟”高剂量组、阳性对照组：肺脏层胸膜无结缔组织增生；部分支气管、肺泡上皮细胞有轻度损伤，有少许炎性细胞浸润，见图1C、图1D。“杆努尽烟”低剂量组：肺脏各级支气管结构正常，部分肺泡上皮细胞已变性坏死，支气管周围和肺间质稍有炎性细胞浸润，可见少许纤维组织增生，见图1E。

2.2 各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-8含量比较

给药28 d 后，用ELISA 法测定肺组织的TNF-α、IL-8 表达含量，模型组TNF-α、IL-8 表达较空白对照组有明显提高，差异有统计学意义（P＜ 0.001）。“杆努尽烟”高剂量组和阳性对照组TNF-α 较模型组降低（P＜ 0.01），IL-8 较模型组降低（P＜ 0.001），高剂量组降低最为显著；低剂量组TNF-α、IL-8 较阳性对照组均稍有增高，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。低剂量组大鼠肺组织TNF-α 表达较模型组降低（P＜ 0.05），IL-8 较模型组降低（P＜ 0.01）。见表2。

表2 各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-8含量比较（mg/L，± s）

注 与空白对照组比较，aaaP ＜ 0.001；与模型组比较，bP ＜ 0.05，bbP ＜ 0.01，bbbP ＜ 0.001，与阳性对照组相比，cP ＜ 0.05；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-8：白介素-8

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2.3 各组大鼠肺组织中c-jun、c-fos蛋白表达比较

给 药28 d 后，用western-blot 法 检 测c-jun、c-fos 表达，与空白对照组比较，各实验组c-jun、c-fos 表达水平均有增加，其中模型组增加最为明显（P＜ 0.001）；与模型组比较，“杆努尽烟”高剂量组和阳性对照组c-jun、c-fos 蛋白表达明显降低（P＜ 0.01），“杆努尽烟”高剂量组c-fos 表达的降低最为显著；较模型组，“杆努尽烟”低剂量组c-jun 下降明显（P＜ 0.05），c-fos 表达有所降低（P＜ 0.01）。见图2。

图2 各组大鼠肺组织c-jun、c-fos 蛋白表达（n=10）

2.4 各组大鼠肺组织c-jun、c-fos mRNA表达

28 d 给药后，检测大鼠肺组织c-jun、c-fos mRNA 的表达如图3 所示，与空白对照组比较，各实验组大鼠肺组织c-jun、c-fos 的mRNA 表达均有明显增高，以模型组表达增加更为显著，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。“杆努尽烟”高剂量组、阳性对照组大鼠肺组织c-jun、c-fos 的mRNA 表达均较模型组明显下降，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；与阳性对照组比较，“杆努尽烟”低剂量组c-jun mRNA 表达增高（P＜ 0.05），c-fos mRNA 有所增高（P＜ 0.01）。

图3 各组大鼠肺组织c-jun 和c-fos mRNA 蛋白表达（n=10）

3 讨论

CB 是常见的呼吸系统慢性炎症性疾病，主动或被动吸烟以及细菌病毒的反复接触感染是CB 主要致病因素之一，故采用LPS 联合烟熏构建CB 大鼠模型。研究显示“杆努尽烟”的主要有机成分包括黄酮类[11]、苯乙醇类[12]、熊果酸[13]等，均具有较好的抗炎效果。本研究结果显示，给药28 d 后，“杆努尽烟”药物组大鼠一般情况得到明显改善，炎症有所好转，HE 染色结果示，炎症细胞浸润情况较模型组明显减少，这提示“杆努尽烟”对CB 大鼠的治疗可能有较好效果，这与胡欣等[5-7，14]前期证实的苗药“杆努尽烟”对CB 大鼠具有一定的抗炎效果的结果一致。

研究显示，AP-1 是目前炎症介导的重要蛋白靶点[15]，其可通过MAPK 信号通路级联反应[16]激活AP-1 信号，传导至下游介导炎症递质释放；也可与细胞胞质内同一类型的转录因子（transcription factor，TF），如核因子激活的B 细胞的κ-轻链增强（nuclear factor kappa-B，NF-κB），通过远距离机制调节，参与炎症的介导。CB 的发病机制与炎症信号通路息息相关，故将AP-1 用作新药物靶向疗法的重点研发对象，可为临床有效遏制CB 的进展带来新的诊疗方向。

本研究造模过程中，存在大鼠因对麻醉药物过敏而导致死亡的案例，但总体死亡数量不影响实验结果的统计学意义。给药28 d 后，检测大鼠肺组织AP-1 蛋白、转录产物mRNA 以及炎症因子TNF-α、IL-8 的表达情况，结果表明“杆努尽烟”药物组大鼠上述成分表达量较模型组均显著降低，因此推测杆努尽烟对可能是通过降低AP-1 蛋白的表达水平，下调下游部分炎性递质TNF-α、IL-8 等生成，抑制肺组织炎性细胞的过分活化，达到了抗炎治疗效果。但本研究并未进一步验证AP-1 和炎症因子TNF-α、IL-8 之间具体的相关性表达，以及活化的AP-1 和炎症因子间表达量的相关性，有待后续实验进一步证实。

综上所述，AP-1 可能在CB 的产生进展中起到一定炎症调节作用，苗药“杆努尽烟”可通过影响其表达水平，抑制气道炎症。