茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐的活性研究及应用

周琴 ，叶海庆，周申艳，邓霞，田竹卉，何强

1.四川大学轻工科学与工程学院（成都 610065）；2.长江师范学院现代农业与生物工程学院（重庆 408100）

茶多酚（tea polyphenol，TP）是广受欢迎的天然抗氧化剂[1]，具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功能活性[2]，也可应用于食品中延长货架期[3]。但茶多酚水溶性强而脂溶性差，性质不稳定[4]，在油脂、含脂肉制品中的应用较为局限。为提高茶多酚的稳定性和应用范围，近年来关于茶多酚改性、微胶囊包埋的研究和应用较为热门[5]。其中，利用脂肪酸改性茶多酚形成茶多酚脂肪酸酯衍生物，可有效提高茶多酚的脂溶性，增强抗氧化、抗炎及抑菌活性[5-7]，在油脂及肉制品中具有很大应用潜力。茶多酚棕榈酸酯（palmitoyl-TP，pTP）是一类典型的茶多酚脂肪酸酯衍生物，于2014年获准为食品抗氧化剂（GB 2760——2014），并已商品化[8]。有关茶多酚棕榈酸酯的报道大多集中在清除自由基、抗炎、抗病毒及抗肿瘤活性方面的理论研究[5-7,9-11]，仅有少量在食品中的应用，如庄谦谦等[12]证实茶多酚棕榈酸酯对牛肉棒具有抗氧化和护色作用。但总体上，人们对脂肪酸改性的脂溶性茶多酚除抗氧化以外的其他活性认识较少。

亚硝酸盐因其在食品体系和体内消化过程中易于形成强致癌物亚硝胺而历来备受关注，降低亚硝酸盐含量被认为是降低致癌风险的有效途径[13]。茶多酚及其主要成分EGCG、儿茶素等均具有良好的清除亚硝酸盐的活性[14]，而经棕榈酸改性的茶多酚酯是否具有清除亚硝酸盐的能力尚未可知，其在食品体系及体内消化过程中能否降低亚硝酸盐残留量也不清楚。因此，研究茶多酚棕榈酸酯及其主要成分EGCG棕榈酸酯（pEGCG）的亚硝酸盐清除活性，可进一步探明茶多酚棕榈酸酯的功能活性和应用潜力，对于促进茶多酚棕榈酸酯及类似的脂溶性茶多酚在食品体系中的应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

商品化pTP（纯度＞70%）、pEGCG（纯度＞90%，其中单苷酯＞55%）、EGCG（纯度98%）：杭州普丽美地生物科技有限公司；茶多酚（纯度99%，Macklin）；不同pH的磷酸盐缓冲溶液（PBS，50 mmol/L，上海源叶生物科技有限公司）；亚硝酸钠、氯化钠、无水乙醇等分析纯试剂（成都科隆化学品有限公司）；猪肉（市售）。

1.2 仪器与设备

JB/T5374型电子天平、FE28型pH计（梅特勒-托利多）；MICCRAD-9型均质机（上海人和）；SB-4200 DTD型超声仪（宁波新芝）；EBR-EB11型恒温水浴锅（上海力辰邦西）；PT-3502C型全波长酶标分析仪（上海闪谱生物科技有限公司）；T6型分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 亚硝酸盐清除反应试验体系

参考Deng等[14]的试验体系，反应液总体积10 mL，包含100 μL亚硝酸钠溶液（5 mmol/L）、100 μL相应浓度的茶多酚酯溶液（pTP或pEGCG，乙醇配制）、9.8 mL相应pH的PBS，对照组以溶剂替代样品溶液，每组3个平行，反应结束后立即取样测定亚硝酸钠含量。

1.3.2 亚硝酸盐测定及清除率计算

以Griess法测定亚硝酸钠[14]含量。取500 μL样品溶液，加入750 μL格里氏试剂Ⅰ精确反应5 min，加入750 μL格里氏试剂Ⅱ反应5 min，于538 nm波长处测吸光度，根据标准曲线算亚硝酸钠含量。亚硝酸钠清除活性以亚硝酸钠清除率衡量，按式（1）计算。

式中：Ccontrol为对照组亚硝酸钠浓度，mmol/L；Csample为反应样品亚硝酸钠浓度，mmol/L。

1.3.3 不同条件下茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐的活性

1.3.3.1 pTP和pEGCG添加量对亚硝酸盐清除率的影响

按照1.3.1试验体系，分别添加亚硝酸钠及相应茶多酚棕榈酸酯，其中pTP和pEGCG在反应体系中的终质量浓度为0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50和0.75 mg/mL，以EGCG为阳性对照，在37 ℃反应1 h后测定亚硝酸盐含量并计算清除率。

1.3.3.2 不同pH对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

采用1.3.1试验体系，分别添加pTP和pEGCG（在体系中终浓度0.5 mg/mL）与亚硝酸钠反应，反应体系的PBS的pH为2.0，3.0，4.0，5.5，6.0和6.5，在37 ℃反应1 h后测定亚硝酸盐含量并计算清除率。

1.3.3.3 不同时间对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

采用1.3.1试验体系，分别添加pTP和pEGCG（终质量浓度0.5 mg/mL）与亚硝酸钠反应，在pH 3、37℃反应，并于0，0.17，0.50，1，2，3，4，5和6 h取样测定亚硝酸盐含量并计算清除率。

1.3.3.4 不同温度对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

采用1.3.1试验体系，分别添加pTP和pEGCG（终质量浓度0.5 mg/mL）与亚硝酸钠在pH 3条件下反应，温度分别设置为4，25，37，60和80 ℃，其中4 ℃的样品组反应24 h，其余样品反应1 h后取样测定亚硝酸盐含量并计算清除率。

1.3.4 乙醇及氯化钠对pTP和pEGCG清除亚硝酸盐的影响

1.3.4.1 乙醇对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

采用1.3.1试验体系，分别添加pTP和pEGCG（终质量浓度0.5 mg/mL），乙醇体积分数相当于体系总体积的1%，2%，4%，6%，8%，10%和12%（V/V），对照组用溶剂替代pTP和pEGCG样品溶液，在37 ℃，pH 3反应1 h后取样测定亚硝酸盐含量并计算清除率。

1.3.4.2 氯化钠对pTP和pEGCG清除亚硝酸盐的影响

采用1.3.1试验体系，添加pTP和pEGCG（终质量浓度0.5 mg/mL），加入氯化钠，使氯化钠在反应体系中的浓度为1%，2%，4%，6%和8%，阴性对照用溶剂替代pTP和pEGCG、PBS替代氯化钠，阳性对照加入2种茶多酚酯并用PBS替代氯化钠，在37 ℃，pH 3反应1 h后取样测定亚硝酸盐含量并计算清除率。

1.3.5 pTP和pEGCG抗氧化活性研究

pTP和pEGCG的抗氧化活性参考谭飔等[15]的DPPH法、ABTS法，采用与1.3.3.1的相同浓度的pTP和pEGCG反应后计算DPPH·和ABTS+清除率，并分别计算与亚硝酸盐清除率的相关性。

1.3.6 pTP和pEGCG在体内外食品体系中清除亚硝酸盐的活性研究

1.3.6.1 pTP和pEGCG在模拟胃液中清除亚硝酸盐的活性

参考美国药典的方法配制模拟胃液，2.0 g氯化钠、3.2 g胃蛋白酶和7 mL质量分数37%的盐酸，用超纯水定容至1 000 mL，测得pH 1.5。按1.3.1试验体系的比例，分别加入100 μL pTP或pEGCG（终质量浓度0.5 mg/mL）、100 μL亚硝酸钠，使其在体系中的终质量浓度为3.45，10，20和50 μg/mL，并用模拟胃液定容至10 mL，在37 ℃反应1 h后取样测定亚硝酸钠含量[16]。

1.3.6.2 pTP和pEGCG对腌制肉糜中亚硝酸盐残留量的影响

取瘦肉与肥肉（8︰2，W/W）斩拌成肉泥，添加亚硝酸钠（150 mg/kg）、氯化钠（2%，g/g）并分为5组：分别添加0.05%（g/g）的TP、EGCG、pTP和pEGCG及1个对照组。充分搅拌混匀后在4 ℃下腌制2和24 h取样，按照GB 5009.33——2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐》测定亚硝酸盐残留量。

1.3.6.3 pTP和pEGCG对乳化肠中亚硝酸盐残留量的影响

参考赵春波等[17]的方法制作猪肉乳化肠，其中抗氧化剂（TP、EGCG、pTP、pEGCG）添加量为0.05%（g/g），对照组不添加抗氧化剂。制作完成后取样按照GB 5009.33——2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐》测定亚硝酸盐残留量。

1.3.7 数据处理

所有样品均为3个平行；数据处理采用Excel 2010；采用GraphPad 8.22对数据进行方差分析（Duncan）；采用基迪奥云平台对数据进行相关性（Pearson）分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 不同条件对茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐的影响

2.1.1 pTP和pEGCG浓度对亚硝酸盐清除率的影响

由图1可以看出，随着pTP、pEGCG添加量增大，亚硝酸盐清除率均逐渐上升。相同质量浓度下，pEGCG清除亚硝酸盐的能力比pTP更强（P＜0.05）。质量浓度0.5 mg/mL时，pTP和pEGCG的清除率分别达到45.99%和77.51%。为更直观对比茶多酚棕榈酸酯的亚硝酸盐清除能力，以EGCG为阳性对照，将pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除活性换算为EGCG当量（表1）。添加量0.5 mg/mL的pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除能力相当于20.44 μmol/L和35.42 μmol/L的EGCG。但浓度再增大，二者亚硝酸盐清除率的上升趋势趋于缓和，这与茶多酚棕榈酸酯在反应体系中的溶解程度有关。

表1 pTP及pEGCG清除活性的EGCG当量

图1 pTP及pEGCG浓度对清除亚硝酸盐活性的影响

2.1.2 不同pH对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

在pTP和pEGCG质量浓度为0.5 mg/mL条件下，随着反应体系中pH升高，二者的亚硝酸盐清除率均逐渐降低（图2），且pEGCG清除能力强于pTP（P＜0.001）。pH 2时，pTP、pEGCG对亚硝酸盐的清除效果最强，清除率分别为53.35%和77.94%，pH 3时的清除率稍低于pH 2，但pEGCG在pH 2与pH 3之间没有显著差异（P＞0.05）。但升高至pH 4以后，pTP、pEGCG清除亚硝酸盐的活性急速下降，直至pH 5.5，6.0和6.5时，二者的亚硝酸盐清除率在这3个pH之间均无显著差异（P＞0.05）。有研究证实，茶多酚只在酸性条件下才具有亚硝酸盐清除的活性[14]，主要由于其酚羟基结构在酸性条件下与NO2-或其分解产物的反应活性更强[14]。而试验结果显示经棕榈酸酯化的茶多酚及其主要成分仍然遵循多酚的亚硝酸盐清除规律，表明尽管棕榈酸酯化了部分茶多酚成分的羟基，其剩余的羟基仍具有一定的反应活性。由于试验中pH 2和pH 3的清除活性较为接近，相关研究也多采用pH 3作为体外模拟胃酸反应体系的条件[14]，因此选择pH 3条件开展后续试验。

图2 pH对pTP及pEGCG清除亚硝酸盐活性的影响

2.1.3 不同反应时间对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

由图3可知，pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率随时间的延长而缓慢上升，但pEGCG更早达到饱和，反应时间达到2 h后其清除率达到87%后就趋于稳定（P＞0.05），而pTP在反应6 h内的清除率逐步升高，主要可能是由于pEGCG的亚硝酸盐清除活性更强，与亚硝酸盐的反应更快，而pTP因成分更为复杂，棕榈酸酯化程度更高，因此与亚硝酸盐的反应更慢。但从清除效果来看，pEGCG在反应1 h时清除率为76.22%，与反应2 h的清除率尽管有显著性差异（P＜0.05），但清除率较为接近，因此综合选择反应1 h开展后续试验。

图3 不同反应时间对pTP及pEGCG清除亚硝酸盐活性的影响

2.1.4 不同温度对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

由图4可以看出，温度对茶多酚棕榈酸酯的亚硝酸盐清除活性影响较大。随着反应温度的升高，pTP、pEGCG的亚硝酸盐清除率均相应升高。pTP在25 ℃和4 ℃几乎不与亚硝酸钠反应（P＞0.05），温度升高到37 ℃时亚硝酸盐清除率升高到46.17%，且37 ℃和60℃的清除率无显著差异（P＞0.05）。此外，pEGCG的清除活性在37，60和80 ℃下分别为77.05%，83.25%和82.64%，60 ℃和80 ℃的清除率几乎没有差异（P＞0.05）。综合来看37和60 ℃的清除率也差异较小，且37 ℃能模拟人体温度，具有一定代表性，因此选择该温度开展其他试验。

图4 不同温度对pTP及pEGCG清除亚硝酸盐活性的影响

图5 乙醇添加量对pTP及pEGCG清除亚硝酸盐活性的影响

2.2 乙醇及氯化钠对茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐活性的影响

2.2.1 乙醇对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

白酒、料酒等常作为食品（如川式香肠）或菜肴的配料，有时酒精饮料也会直接被摄入，对体内外亚硝酸盐的转化可能产生影响。乙醇被报道在模拟胃液的条件下具有降低亚硝酸盐含量的作用[18]，因此试验考察了乙醇对两种茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐活性的影响。结果表明，乙醇添加量为1%时，pTP、pEGCG对亚硝酸盐清除率与不添加乙醇无明显差异（P＞0.05）。因此，试验采用乙醇配制样品扩大百倍浓度加入反应体系对试验结果没有显著影响。但乙醇添加量增加至2%开始，2种茶多酚棕榈酸酯的亚硝酸盐清除率开始急剧上升，乙醇添加量达到4%时pEGCG处理组的亚硝酸盐被完全清除，而pTP组在乙醇添加量升至8%也达到同样状态。由于乙醇上含有羟基，本身具有一定的清除亚硝酸盐的活性[18]，因此对反应体系的亚硝酸盐有较强的影响。从试验结果来看，乙醇添加量高于8%，乙醇清除亚硝酸盐就占主导作用。乙醇添加量低于8%，pTP与pEGCG二者清除率的折线并不重合，pEGCG的清除效果仍比pTP强，表明乙醇添加量低于8%起到了一定清除亚硝酸盐作用，但未完全取代茶多酚棕榈酸酯的作用。

2.2.2 氯化钠对pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除率的影响

食盐作为食品必不可少的配料，对食品体系或体内消化时亚硝酸盐的清除是否有影响尚不明确。因此进一步探讨不同浓度氯化钠对茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐的影响。结果表明，氯化钠会强力抑制两种茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐的活性。从图6可以看出，从添加氯化钠开始，pTP和pEGCG的清除率就迅速降低；随着氯化钠的浓度进一步升高，二者的清除率甚至降为负数。表明氯化钠不仅抑制pTP和pEGCG清除亚硝酸盐的反应，甚至抑制了酸性条件下NO2-本身的分解作用，使得体系中的NO2-浓度升高。主要原因可能有两方面，一方面NaCl的添加增强溶液的离子效应，Na+和Cl-抑制NO2-在酸性条件下分解为NO+的歧化作用[19]，另一方面，强的离子效应也可能会抑制酚羟基与NO2-或NO+的反应。因此，在食品体系中应用茶多酚及其酯化物时，也应考虑氯化钠对其功能活性的影响。

图6 氯化钠添加量对pTP及pEGCG清除亚硝酸盐活性的影响

2.3 茶多酚棕榈酸酯清除DPPH·和ABTS+的活性

2.3.1 pTP及pEGCG清除DPPH·和ABTS+的活性

如图7和图8所示，pTP和pEGCG清除DPPH·和ABTS+的活性都很强，且在0.50~0.75 mg/mL的质量浓度下，二者对两种自由基的清除率均没有显著差异（P＞0.05），这与已报道的研究结果一致[6-7]。质量浓度升高至0.3 mg/mL后，两种茶多酚酯对这两种自由基的清除率均达到饱和，印证茶多酚棕榈酸酯的强抗氧化活性。

图7 pTP及pEGCG清除DPPH·的活性

图8 pTP及pEGCG清除ABTS+的活性

2.3.2 pTP及pEGCG的亚硝酸盐清除能力与自由基清除的相关性分析

分别对pTP、pEGCG的亚硝酸盐清除率和自由基清除率进一步做相关性分析，结果显示（图9），pTP的亚硝酸盐清除率与DPPH·和ABTS+清除率的相关系数分别为0.871和0.876，pEGCG的则为0.790和0.839。2种茶多酚棕榈酸酯的亚硝酸盐清除活性均与自由基清除能力呈正相关关系（P＜0.05）。由此可以推测，植物多酚在酸性条件下降低亚硝酸盐含量，可能主要是通过自由基途径下羟基与NO2-歧化产生的含N自由基反应从而降低亚硝酸盐含量[14]。试验同时表明，茶多酚棕榈酸酯清除亚硝酸盐的机制可能与未酯化的多酚类似，也与其自身的酚羟基清除自由基的能力有关。

图9 pTP及pEGCG清除亚硝酸盐活性与抗氧化能力的相关性分析

2.4 茶多酚棕榈酸酯在不同食品体系中的应用

2.4.1 pTP及pEGCG在模拟胃液中清除亚硝酸盐的活性

为进一步探讨茶多酚棕榈酸酯在胃液消化体系下的清除亚硝酸盐的活性，试验以美国药典方法配制模拟胃液，添加pTP及pEGCG分别验证其对亚硝酸钠清除的影响。结果显示，由于模拟胃液的酸性很强，且其中有胃蛋白酶等成分的综合作用，亚硝酸钠大部分已分解。浓度50和20 μg/mL的亚硝酸钠对照组反应1 h后仅残留量分别为10.73和3.42 μg/mL（图10）。50 μg/mL的样品组添加pTP和pEGCG反应后亚硝酸钠残留量分别降至1.33和1.97 μg/mL，比对照组（10.73 μg/mL）分别降低87.52%和82.17%。在该体系下pTP降低亚硝酸盐的活性强于pEGCG（P＜0.001）。其余浓度下添加茶多酚棕榈酸酯的样品组的吸光度均低于标曲线性范围无法定量或没有检出，清除率接近100%。由此可见在模拟胃液体系中pTP和pEGCG的清除活性比纯的缓冲溶液体系中更强，可能是由于在模拟胃液的强酸性（pH 1.5）和酶的共同作用下，茶多酚棕榈酸酯易被水解为未酯化的EGCG及其他茶多酚成分的形态，增强水溶性及其酚羟基的数量，使其亚硝酸盐清除活性进一步增强。也表明棕榈酸酯摄入体内后在消化过程中可能会通过水解转化为未酯化的形态从而发挥出类似于未酯化茶多酚的活性，这一发现对于类似的茶多酚脂肪酸酯衍生物在食品中的应用和体内研究方面具有重要的参考价值。

图10 模拟胃液中pTP及pEGCG清除亚硝酸盐的活性

2.4.2 pTP和pEGCG降低腌制肉糜中亚硝酸盐残留量

如图11所示，添加茶多酚、茶多酚棕榈酸酯（TP、pTP）及其主要成分（EGCG、pEGCG）均能有效降低腌制肉糜的亚硝酸盐残留量。肉糜腌制2 h，对照组、TP、EGCG、pTP和pEGCG组样品的NaNO2残留量分别为130.4，90.24，104.06，61.43和78.45 mg/kg。腌制24 h后5组的NaNO2残留量进一步降至88.07，57.07，80.37，36.55和70.42 mg/kg。4种成分中，pTP在腌制2和24 h时对亚硝酸盐的降低作用均为最强（P＜0.05）。尽管试验的腌制温度很低（4 ℃），但pTP和pEGCG在腌制肉糜体系中均表现出比模拟的缓冲溶液体系更强的降低亚硝酸盐含量作用，表明其在肉制品中应用的效果较好。各类猪肉丸、牛肉丸等肉糜类产品因美味便捷一直广受消费者喜爱[20-21]。茶多酚棕榈酸酯在低温条件下降低肉糜中亚硝酸盐残留量的优越表现，说明其在类似产品中具有较大的应用潜力。

图11 pTP及pEGCG降低腌制肉糜中亚硝酸盐的活性

2.4.3 pTP和pEGCG降低乳化肠中亚硝酸盐残留量

进一步添加0.05%（g/g）的茶多酚及其棕榈酯化物制作猪肉乳化肠，结果显示（图12），pTP和pEGCG处理组乳化肠的亚硝酸盐残留量分别为49.13和53.06 mg/kg，均显著低于对照组（61.98 mg/kg，P＜0.05）和EGCG处理组（P＜0.05），表明在乳化肠体系中pTP和pEGCG也具有明显的降低亚硝酸盐的作用。乳化肠的配方和工艺相对复杂，对茶多酚棕榈酸酯的作用的发挥有多方面的影响。茶多酚棕榈酸酯的抗氧化性、降亚硝酸盐、着色作用使其在部分替代乳化肠中亚硝酸盐和抗坏血酸等添加剂具有较大的研究和应用潜力。

图12 pTP及pEGCG降低乳化肠中亚硝酸盐的活性

3 结论

结果表明，茶多酚棕榈酸酯pTP及其主要成分pEGCG在各类体系中均具有较好的亚硝酸盐清除活性。在缓冲溶液体系中，pTP和pEGCG均在酸性条件、温度高于37 ℃时具有亚硝酸盐清除能力，且相同质量浓度下pEGCG清除亚硝酸盐的活性比pTP更强。乙醇体积分数高于2%会增强体系中的亚硝酸盐清除效果，但氯化钠会抑制pTP和pEGCG的清除作用，且浓度越高抑制作用越强。结合抗氧化结果表明，pTP和pEGCG的亚硝酸盐清除能力与DPPH·及ABTS+清除能力呈正相关关系。将两种茶多酚棕榈酸酯进一步应用于模拟胃液、腌制肉糜、乳化肠体系中，pTP和pEGCG均能有效降低亚硝酸盐残留量。试验结果对于茶多酚棕榈酸酯及类似的脂肪酸酯改性的脂溶性茶多酚的活性研究及应用具有一定参考价值。