MALDI-TOF MS在食品掺假鉴别研究中的应用

李晓芹，禹超，王伟，方志娟

1.苏州市食品检验检测中心（苏州 215104）；2.杭州羽嬉贸易有限公司（杭州 310000）

随着食品加工工艺日益复杂化，食品质量等级难以通过感官直观辨别。为获取更多经济利益，食品掺假愈发多样和隐蔽，如以次充好[1]、虚假标签、产地造假等。食用油脂、乳制品、肉制品、酒类、调味品、饮料和蜂产品等7类产品占所有掺假食品类别的90%以上，牛奶、橄榄油和蜂蜜高居掺假食品产品前三[2]，困扰消费者和相关监管部门。

常规的定向检测手段针对食品添加剂、违法添加物、农兽药等已知成分，难以应对复杂多变的食品掺假现象[3]。非定向分析是近年来伴随仪器技术进步发展起来的检测理念，可依据不同生物体具备特征性的蛋白质、脂质、核苷酸等的表达，结合化学计量学进行聚类分析开展的检测技术，具有安全风险识别能力，是食品质量安全领域的研究热点。高分辨质谱技术、基因检测技术、核磁共振分析、同位素分析、基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）等新兴技术在非定向食品掺假的研究中都得到一定的探索和应用[4-5]。鉴于此，从技术原理，以及在乳制品、肉与肉制品、水产品、食用油、蜂蜜等掺假中的应用等方面，阐述MALDI-TOF MS在食品掺假中的研究进展。

1 MALDI-TOF MS技术原理

MALDI-TOF MS是用激光轰击待测物与基质形成的共结晶薄膜，使其快速爆炸性蒸发，在这个过程中基质离子与待测物间发生电荷转移，使待测物离子化。电离的生物分子在电场的作用下，通过飞行管道到达检测器，不同质荷比的带电离子飞行的速度不同，根据到达检测器的时间和带电离子数量，获得该待测物的图谱[6-7]。

MALDI的电离方式为软电离，不会导致生物分子发生链断裂，能在离子化的过程中保持完整[8]。MALDI-TOF MS有很强的基质依赖性，基质的选择对分析物的离子化起着至关重要的作用。α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）一般用于蛋白质特性表征中，2, 5-二羟基苯甲酸（DHB）用于糖分子相关的研究[9]，2,4, 6-三羟基苯乙酮（THAP）或3-羟基吡啶甲酸（3-HPA）用于核苷酸的研究中[10]。

MALDI-TOF MS具备操作简单、检测范围广、分辨率高、检测速度快、重现性好等特点[11]，不但适用于蛋白质、糖肽等的高通量筛选，还可对脂质、核苷酸、微生物鉴定分型等进行分析[12-13]，尤其在微生物领域应用相对成熟[14]。关于MALDI技术已发布实施的食品相关检测标准有GB/T 33682——2017《基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》[15]，SN/T 3872——2014《出口食品中四种致病菌检测方法MALDI-TOF-MS法》[16]和SN/T 5228系列标准[17]，显示其在细菌、酵母菌，真菌等鉴定方面的可行性[18]。在食品掺假中的应用还处于研究阶段，未形成标准方法。

2 MALDI-TOF MS在食品掺假鉴别中的应用

2.1 乳制品

实现乳制品掺假鉴别，可利用MALDI技术筛选标志物，通过特征性标志峰作为考察重点进行辨别。Calvano等[19]通过分析MALDI-TOF MS磷脂指纹图谱检测牛奶掺假。以生鲜牛乳、市售牛奶，以及绵羊奶、山羊奶和牛奶的混合物为研究对象，对脂质提取物进行扫描分析，筛选出质荷比703和706的2个带电离子为特征峰，以其丰度比作为参考进行掺假鉴别。

通过样本采集获得该品类的指纹图谱，通过化学计量学建立数据模型进行鉴别[20]。卜汉萍等[8]将鲜奶样品经0.1%三氟乙酸水溶液稀释，与芥子酸溶液混合点靶板，待样品干燥后载入MALDI-TOF MS，将酪蛋白和乳清蛋白等重要分子量信息及响应变化作为考察目标，通过主成分分析（PCA）分析不同2个产地和2个季节的鲜奶的图谱数据，建立蛋白质信息数据库。该方法能够快速检测含有0.3%（m/m）猪皮明胶、大豆分离蛋白或乳清蛋白的掺假鲜奶。Garcia等[21]通过简单的正己烷提取，采用MALDI-TOF MS技术获得脂肪指纹图谱，结合PCA等分析技术建立数据模型，可以用于检测奶粉中10%的植物油掺假。

MALDI在小分子化合物分析方面也有一定应用。Su等[22]将SBA-15与CHCA和3-APTES形成的离子液体共价连接合成新型基质，建立MALDI-TOF MS检测牛奶样品中三聚氰胺的高通量筛选方法，并对溶剂、基质悬浮液浓度、基质与样品比例、沉积策略、干燥方法、样品制备方法等参数的影响进行考察。该方法检出限达0.10 mg/kg，SRSD≤14%。

2.2 肉与肉制品

肉及肉制品的掺假问题，较常见的如将价格较低的猪肉、鸡肉、鸭肉等全部或部分代替价格较高的牛肉或羊肉。烹饪和冷冻储藏对肉制品本身的改变在参加鉴别中也需要充分考虑。

施姿鹤[23]根据蛋白质N-糖基化修饰的特异性，利用MALDI-TOF MS分析不同肉中N-链寡糖组的结构差异，并依此建立了肉类真伪鉴别的UPLC方法，运用于鸡、鸭、猪、牛、羊肉的二元、三元及加工肉制品掺假的鉴别，检出限达到2.2%，烹饪后仍能鉴别10%比例的掺假肉。

蒲科源等[24]利用MALDI-TOFMS的高通量采集功能，得到牛、鸡、鸭、猪4种生肉的129个离子峰和熟肉的151个离子峰，筛选11个特征蛋白质峰，再结合PCA分析，构建牛肉掺假鉴别模型，在25%，50%和75%质量比条件下鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉都可有效区分，生、熟状态下的掺假牛肉均能得到鉴别，可在3 h内完成对384个样品的检测，实现高通量分析。

Flaudrops等[25]提取蛋白质后，用MALDI-TOFMS系统结合数据分析软件进行聚类分析，将猪肉、牛肉、马肉、牛肉和鸡肉有效的分成不同的质谱簇，以准确区分肉类来源。同时根据特征峰，区分猪肉明胶和牛肉明胶。

2.3 水产品

江浙地区大闸蟹养殖普遍，因产地不同价格差异较大，但市场上冒充较多，假冒手段层出不穷，即便通过特殊标记也难以鉴别真假。金萍等[26]采用0.1%的三氟乙酸提取大闸蟹的蟹鳌和蟹身的肌肉组织蛋白，加入芥子酸作为基质，通过MALDI-TOF MS技术获得特征性指纹图谱，借助夹角余弦相似度分析给和偏最小二乘法判别分析，寻找到2种大闸蟹肌肉组织蛋白质在质谱图上的差异，能够非常直观地将2种大闸蟹进行分类。

Salla等[27]利用MALDI-TOF MS和质谱指纹匹配分析软件，建立质谱参考数据库，对6个不同物种的虾进行鉴别。使用来自这6个物种的74个未知虾样本进行测试验证，在74个样本中，有72个样本得到正确鉴定，正确率97%。

Gesche等[28]使用MALDI-TOF MS评估不同储存温度和加工方式对高脂肪大西洋鲭鱼和低脂肪虹鳟鱼的光谱质量和重现性的影响。结果表明，用25%甲酸和氯仿-甲醇制备样品，能获得新鲜和冷冻状态下、高脂肪和低脂肪鱼的可重复和高质量的图谱。除熏鱼外，样品在99 ℃处理5 min或者在-20 ℃下储存14个月，MALDI-TOF MS的鉴定结果仍能保证重现性。

2.4 食用油

在食用植物油消费领域，以次充好甚至“地沟油”等欺诈消费者的情况依然存在。传统的酸价、过氧化值，甚至辣椒素检测，都存在一定缺陷[29]。

Jergović等[30]建立基于MALDI-TOFMS技术的快速检测特级初榨橄榄油（EVOO）掺假的方法。研究通过MALDI-TOF MS扫描获得EVOO中特异性三酰甘油的指纹图谱，通过添加1%，10%和20%（w/w）葵花籽油、精炼橄榄油和初榨橄榄油模拟掺假，通过比较分析，能够有效鉴别掺假EVOO，检出限低至1%，并且能够有效区分来自不同地理区域的EVOO样品。

Ng等[31]对包括30种900余批次食用油样品进行分析比较，获得每种食用油的特征峰，并进行PCA分析。根据数据模型结果，将900余批次食用油分为8类。利用偏最小二乘法判别分析对435种食用油产品进行分类，总体正确率为97.2%，对常用食用油鉴别的正确率接近100%。

Peršurić等[32]比较MALDI-TOF MS、GC-MS和近红外光谱3种方法对EVOO产地的鉴别潜力，发现采用MALDI-TOF MS测定三酰甘油组成对EVOO产地具有最好的分类能力，能够实现对橄榄油特性的完整表征。

2.5 蜂蜜

蜂蜜是一种天然的甜味剂，同时具有一定药用价值，用廉价糖浆冒充或者以次充好等[33]蜂蜜掺假现象普遍。

屈亮亮[34]以DHB为基质对蜂蜜、糖浆和10%糖浆掺假蜂蜜进行MALDI技术分析，结果发现掺假蜂蜜在多糖聚合度及糖类分布趋势上和蜂蜜样品存在差异，建立一种无需样品预处理的、高通量蜂蜜掺假检测方法，该方法能够实现蜂蜜植物源的鉴别；提出以盐酸萘乙二胺（NEDC）为基质，基于寡糖异构体组成差异鉴别蜂蜜掺假。获取洋槐蜜、荆条蜜和枣花蜜的指纹图谱，并结合多变量分析实现3种蜂蜜的快速区分。

宗凯等[35]利用MALDI-TOFMS对44种不同产地和品种的蜂蜜中分离出44株芽孢杆菌进行鉴定分型和聚类分析。结果表明，相同品牌的蜂蜜样品能稳定分离到芽孢杆菌，获得的蛋白指纹图谱具有重复性，可作为一种新的蜂蜜产地和品种溯源的方法。

3 结语

MALDI-TOF MS在食品中的掺假鉴别，主要通过对特征性标志物筛选和数据模型鉴别实现，是非靶向筛选，具备巨大的应用潜力，已在乳制品、肉制品、水产品、食用油、蜂蜜等多种食品的掺假鉴别中广泛应用，针对品种、产地、季节等均可实现有效区分，前处理简单、检测范围广、分辨率高、检测速度快、重现性好。目前MALDI-TOF MS技术主要还是在研究阶段，研究对象多为初级农产品。食品种类繁多，性质千差万别，构成复杂，MALDI-TOF MS技术在加工食品掺假鉴别中依然有很多的探索空间，在标志物筛选和数据模型建立还需要大量数据和验证工作，有待进一步的研究和深入。