紫苋籽粒提取物的抗氧化特性

王云峰，金铁岩，王龙宇，王宇婷，熊思瑞

延边大学农学院（延吉 133002）

近几年的科学研究证实，谷物中存在着相当多的营养价值，包括黄酮类化合物、多酚类化合物、维生素、氨基酸，以及矿物质等成分[1]，这些物质对于高血压、高血脂、糖尿病以及心脑血管等疾病有着潜在的抑制作用，因此谷物也被视为健康膳食宝塔的重要组成部分，约占每日膳食总量的20%[2]。

假谷物是指一类和谷物生理结构相似的阔叶作物，但却与传统谷物没有植物学上的亲缘关系。假谷物是一种富含不饱和脂肪酸的高淀粉无麸质膳食，能为人类提供高质量的蛋白质。所以它是一种重要的能量来源物质[3]。另外，它还含有重要的营养元素以及生物活性成分，如多酚、黄酮和角鲨烯等[4]。紫苋籽粒所含有的营养物质与谷物相近，有些假谷物的蛋白质含量稍高于谷物，可以被研磨成细细的粉末进行冲食，甚至可以作为主食或代替主食[5]。从植物学角度来看，紫苋籽粒、荞麦和藜麦它们属于双子叶植物，并非真正的谷物[6]。而大多数全谷物（如小麦、大麦、玉米等）属于单子叶植物，因此紫苋籽粒、荞麦和藜麦等被称为“假谷物”，因为它的成分和功能与全谷物相似。现今，越来越多的学者和研究人员从假谷物中发现具有保健功效的生物活性成分，并且假谷物可代替全谷物，为部分对全谷物过敏的群体提供了营养均衡的替代品[7]。所以，假谷物已经成为食品科学领域研究的一个重要课题。

紫苋籽粒（amaranth）与荞麦、藜麦类似，也不是真正的谷物，属于假谷物范畴。同时，紫苋籽粒的功能和组成与大米、藜麦、高粱等谷类类似，且不含麸质，现在已被列入到常规谷物食品中[8]。紫苋籽粒的粒径很小，呈双凸状，颜色呈黄、紫黑色，是一种与谷类类似的作物，紫苋籽粒含有丰富蛋白质和多酚，具有很高的营养价值。紫苋籽粒粉末可用于食品加工、化妆品制造以及饲料添加剂等方面，在国外已广泛栽培植株。不同于大多数单子叶谷物（例如小麦、大米、大麦），紫苋籽粒是一种双子叶植物[6-8]。它具有良好的适应性，可在3 300 m以上的高度生长，也可以适应各种严苛的环境（盐碱、酸性或碱性土壤：干燥；低温和高温）[9]，所以是一种很有潜力的耐旱作物。紫苋籽粒菜叶是一种一年中大部分时间都可以迅速生长的植物，由于其种子和叶片具有极好的营养价值，所以经常被非洲东部地区的居民当作一种蔬菜来吃[10]。这种既古老又富有营养的谷物引起了人们的注意[11]。紫苋籽粒也成为了一种健康的无麸质膳食中的代用品[12]。研究显示，多酚类物质具有抗衰老、抗炎症等功能，而这些功能都与其抗氧化能力（即清除自由基能力）息息相关[13]，常被应用于保健食品和一般食品中，以提高产品的保质期。但目前尚无有关紫苋籽粒抗氧化活性、抗肿瘤活性及其他活性的确切资料。目前市场上使用的紫苋籽粒多用于畜牧业和饲料工业，并未得到很好的应用。因此，如何更好地发挥天然植物的作用，研究紫苋籽粒的抗氧化能力就成了一个十分重要的课题。

结合紫苋籽粒研究目的和研究现状，此试验分析了紫苋籽粒在不同溶剂提取物中总多酚和总黄酮含量，以及提取物对DPPH、ABTS自由基的清除能力，找出最优提取溶剂，希望为紫苋籽粒的食品科学研究提供基础数据，能为今后紫苋籽粒抗氧化性的评价提供有效的基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

紫苋籽粒（珲春市密江镇下洼子村）；甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇（分析纯，天津市科密欧试剂有限公司）；福林酚、DPPH 试剂、没食子酸、芦丁（上海市麦克林生化科技有限公司）；过硫酸钾、碳酸钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；ABTS 溶液（上海源叶生物科技有限公司）；维生素C（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 主要仪器与设备

FA-N/JA-N电子天平（上海一恒科学仪器有限公司）；FA1104分析天平（上海市精科天平公司）；101B电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）；SY-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FD-1A-50真空冷冻干燥机（上海豫明仪器有限公司）；U-3900紫外分光光度计（日立高科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 活性成分的提取

准确称取500 g预处理后的紫苋籽粒粉，按料液比1∶30（g/mL）与体积分数为80%的乙醇溶液混合均匀，搅拌提取24 h，重复提取3次，进行抽滤，合并3 d的滤液，通过旋转蒸发仪在60 ℃并减压的条件下进行旋蒸浓缩，除去绝大部分的溶剂后，在真空冻干机中进行冻干24 h以上，直至粉末状，最终得到139.545 9 mg醇类粗提物粉末。留取5 mg粗提液进行下一步分析，将其余样品与500 mL正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、蒸馏水进行连续萃取，再在旋转式蒸发器中进行减压浓缩，去除大部分溶剂，并冷冻干燥，获得5种不同的溶剂粉末。在分析之前，用50 mL的无水乙醇将5 mg的粗提取物和5 mg不同的组分溶解。

1.2.2 总多酚含量测定

文中采用的方法是福林-酚（Folin-Ciocalteu）比色法。

1.2.2.1 没食子酸标准溶液的制备

参考党斌[14]的方法进行制备。

1.2.2.2 不同溶剂提取物的总多酚含量测定

总酚含量测定参照文献[11]。样品中总酚含量按式（1）计算。

式中：P为通过标准曲线计算得到的含量，μg；M为样品质量，g。

1.2.3 总黄酮含量测定

文章为对比紫苋籽粒6种溶剂提取物的总黄酮含量提取效果，采用GB 1886.89——2015《食品安全国家标准 食品添加剂 甘草抗氧化物》中的方法进行测定。

1.2.3.1 芦丁标准溶液的制备

参考薛琼等[15]对绿豆衣和绿豆仁中黄酮含量的测定与比较的方法制备。

1.2.3.2 不同溶剂提取物的总黄酮含量测定

取2 mL用上述提取液样品，按照芦丁标准溶液制配方法制配待测溶液。提取物中总黄酮的含量以芦丁当量表示，单位为mg/g。样品中总黄酮含量按公式（2）计算[24]。

式中：P为通过标准曲线计算得到的含量，μg；M为样品质量，g。

1.2.4 DPPH自由基清除性能测定

参考慕钰文等[13]的方法。按照式（3）可以计算推导出DPPH自由基清除能力。

式中：R为DPPH自由基清除率，%；A0为空白吸光度；A1为样品吸光度；A2为对照吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除性能测定

总黄酮含量测定按照张鑫[11]的试验步骤进行。计算紫苋籽粒提取物对ABTS自由基清除率（%），按式（4）计算。

式中：A1为ABTS工作溶液+蒸馏水的吸光度；A0为ABTS工作溶液+紫苋籽粒提取物的吸光度。

1.2.6 数据处理

试验结果均采用平均值±标准差（±SD）形式表示，试验数据以及柱形图均采用2016 Excel软件进行作图和数据统计，用SPSS 25.0软件进行差异分析，所有试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取对紫苋籽粒多酚含量的影响

2.1.1 没食子酸标准曲线

以没食子酸为标准品绘制的标准曲线，方程为y=0.109x-0.010 5（R2=0.997 9），如图1所示。在测试浓度范围内没食子酸浓度与其在750 nm处的吸光度存在良好的线性关系。

图1 没食子酸标准曲线

2.1.2 不同溶剂提取紫苋籽粒所得的提取物的多酚含量测定

不同溶剂提取紫苋籽粒所得的提取物的多酚含量见表1。

表1 紫苋籽粒不同溶剂提取物的多酚含量 单位：mg/g

不同溶剂提取物浓缩干燥后制得的多酚得率，含量顺序依次为80%乙醇相＞蒸馏水相＞甲醇相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。其中，体积分数为80%的乙醇相紫苋籽粒提取物多酚的含量最高，为19.86±0.72 mg/g，而正己烷相的多酚含量最低，仅有2.97±0.69 mg/g，这可能是因为醇水混合提取液更有利于提取水溶性和醇溶性的多酚物质。结果与陆健等[16]对大麦总多酚的提取效果相似，但师聪等[17]在对不同溶剂提取覆盆子中的总多酚所得的含量进行比较时发现，乙酸乙酯相比于其他有机溶剂具有较好的提取效率。综上所述，样品的溶剂种类、化学组成和物理特性对生物活性成分的提取效果都有较大影响。

2.2 不同溶剂提取对紫苋籽粒黄酮含量的影响

2.2.1 芦丁标准曲线

芦丁标准曲线如图2所示。

图2 芦丁标准曲线

按照上述方法，以横坐标为芦丁标准溶液的浓度（x/μg·mL-1）、纵坐标为吸光度（y），绘制出芦丁标准曲线（图2），得到线性回归方程：y=0.019 48x-0.018 8（R2=0.993 9），线性相关性良好。结果符合比尔定律，芦丁标准品溶液在该范围内有良好的线性关系。

2.2.2 不同溶剂提取紫苋籽粒总黄酮含量

不同溶剂提取紫苋籽粒总黄酮含量见表2。

表2 不同溶剂对黄酮类物质提取效果的影响 单位：mg/g

6种提取物的总黄酮含量顺序按从多到少排序，依次为80%乙醇相＞蒸馏水相＞甲醇相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。结果证明，紫苋籽粒80%乙醇提取物总黄酮含量最高，达到16.58±0.37 mg/g，蒸馏水提取物效果次之，提取液中总黄酮的含量达到8.12±0.05 mg/g，正己烷提取物总黄酮的含量较低，仅有2.14±0.14 mg/g。其原因可能与糖基化合物在正己烷中的溶解度较小，黄酮类成分大多属于中等极性有关，因此，在正己烷溶液中的溶解量较小。

2.3 不同溶剂提取对紫苋籽粒抗氧化活性比较

2.3.1 不同溶剂提取物对DPPH自由基清除性能的测定

通过分析对比紫苋籽粒不同溶剂提取物的抗氧化性与VC对DPPH自由基溶液清除率的相对差异，来确定紫苋籽粒的抗氧化活性水平。清除率越大，抗氧化活性也就越大。利用DPPH法来检测紫苋籽粒不同溶剂提取物的抗氧化活性，结果见图3。

图3 不同溶剂提取物对DPPH自由基清除性能的测定

从图3可以看出，在利用不同极性溶剂提取所得的紫苋籽粒提取物测定DPPH自由基清除率中，VC阳性对照品的清除率最强，高达81.48%，说明其抗氧化能力最好。提取物对DPPH自由基的清除能力顺序为80%乙醇相＞蒸馏水相＞甲醇相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。其中，体积分数为80%的乙醇作为提取剂提取紫苋籽粒的提取物的抗氧化活性有最大清除率，为38.46%，但是和VC相比要小，而正己烷相的抗氧化活性最低，仅达到7.26%。不同溶剂提取紫苋籽粒活性物质的DPPH清除能力同样存在显著差异（P＜0.05）。

2.3.2 不同溶剂提取物对ABTS自由基清除性能的测定

通过ABTS自由基清除能力测定抗氧化能力的方法，也叫TEAC（Trolox Equal Antioxidant Capacity）法。它由于操作简单且效果明显而被广泛应用于测定各种物质抗氧化的分析。ABTS具有一个特征吸收峰，一般在734 nm处，在该处检测其吸光度，并以此来评估对ABTS自由基清除能力，清除率越高，抗氧化能力越高。

利用ABTS自由基检测紫苋籽粒不同溶剂的提取物的抗氧化活性，结果如图4所示。

图4 不同溶剂提取物对ABTS自由基清除性能的测定

图4表示，在利用这6种不同溶剂提取紫苋籽粒所得的提取物对ABTS自由基清除率试验中，VC阳性对照品的清除率最强，高达87.68%，说明VC的抗氧化能力是这几种测样中效果最好的。提取物对ABTS+自由基的清除顺序依次为80%乙醇相＞蒸馏水相＞甲醇相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。其中，体积分数为80%的乙醇提取紫苋籽粒所得的提取物抗氧化能力最强，达到40.97%，而正己烷相的抗氧化活性最低，仅达到10.86%。此结果与刘禹等[18]研究的高粱米不同溶剂提取物的抗氧化活性中ABTS法检验结果不同。但结合前人的研究可以发现，无论是假谷物还是普通谷物，它们对ABTS自由基的清除能力均不高。

3 结论

试验利用不同有机溶剂浸提紫苋籽粒，得到不同溶剂提取物，并对不同溶剂提取物中总多酚、总黄酮类物质进行抗氧化性研究，试验结果如下：

紫苋籽粒6种溶剂提取物的总酚含量提取效果最优的为80%乙醇提取物，总多酚含量19.86±0.72 mg/g，而其他溶剂提取物多酚含量提取效果为80%乙醇相＞蒸馏水相＞甲醇相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。紫苋籽粒6种溶剂提取物的总黄酮含量提取效果最优的是80%乙醇提取物，黄酮含量可达16.58±0.37 mg/g，提取效果从强到弱为80%乙醇相＞蒸馏水相＞甲醇相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞正己烷相。6种溶剂提取出的总多酚、总黄酮类物质对DPPH自由基均具有一定的清除能力，清除效果最好的是体积分数为80%的乙醇提取紫苋籽粒所得的提取物，可达38.46%。从6种溶剂提取出的总多酚、总黄酮类物质对ABTS自由基也具有一定的清除能力，清除效果最好的是80%乙醇溶液提取紫苋籽粒所得的提取物，可达40.97%。从6种溶剂中提取的总多酚和黄酮类化合物的抗氧化活性间有一定差异。

紫苋籽粒80%乙醇作为提取溶剂，所得的提取物与其他提取溶剂的提取物相比具有更好的抗氧化性，它对DPPH自由基清除能力比其他溶剂提取物的清除效果更强，达到38.46%，它对于ABTS自由基的清除能力也是最优的，清除率可达40.97%。试验比较了6种不同溶剂提取紫苋籽粒所得的提取物的总多酚和总黄酮的含量，结果证明：体积分数为80%的乙醇相对于其他5种溶剂对紫苋籽粒总多酚和总黄酮的提取效果最优，体积分数为80%的乙醇是最理想的提取溶剂。但仍需要对其抗氧化性做出进一步的研究，对其抗氧化作用及抗氧化机理做出进一步的探讨。