微RNA-125a-5p和维生素D受体微RNA在乙型肝炎病毒相关性肝癌中的表达及与预后的关系

李玉苓，邹东花，高健

作者单位：1沧州市第三医院，a中西医结合肝病科，b检验科，河北 沧州 061000；2河北医科大学第三医院肝胆外科，河北 石家庄050000

肝癌是全球男性第五大常见癌症，女性第九大癌症，同时也是癌症死亡的第二大常见原因，其中肝细胞癌是最常见的肝癌类型［1-2］。全球约有3.5 亿人感染乙型肝炎病毒（HBV），而HBV 感染是引起肝细胞癌的最主要原因；慢性HBV 感染期间机体免疫反应所引起的反复肝脏炎症可导致肝纤维化和肝硬化，从而加速肝细胞更新，增加肝癌发生概率［3-5］。近年来，医疗水平不断进步，肝癌的诊疗手段不断完善，但肝癌病人术后复发率及死亡率仍较高［6］，探索可能影响病人预后的新靶点，将其转化并应用于临床，对改善肝癌病人预后有重大意义。

微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）是一种肿瘤抑制因子，在多种癌症中下调［7-8］，研究发现，miR-125a-5p 在肝癌组织和细胞系中表达低于正常肝组织和肝细胞，过表达miR-125a-5p 可抑制肝癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡［9］。维生素D 受体（VDR）水平能够影响肿瘤细胞的发展变化及转归，可调控肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡［10］，研究发现，肝癌组织中VDR mRNA 及蛋白水平均高于正常肝组织，VDR 可能参与肝癌疾病进展［11］。本研究致力探索miR-125a-5p及VDR水平对于HBV相关肝癌病人预后的影响，以期能够找出新分子靶点，提高肝癌病人预后生存质量。

1 资料与方法

1.1 一般资料样本量计算：利用PASS 15 软件，双侧检验，设α=0.05，OR=2，power=90%，计算得到肝癌组织和癌旁组织各49 例，考虑可能有失访人数，按20%算，肝癌组织、癌旁组织至少需要61 例。前瞻性随机选取2014 年2 月至2016 年5 月在沧州市第三医院接受手术治疗的HBV 相关肝癌病人65例，男43 例，女22 例，年龄范围29～67 岁，年 龄（46.32±9.47）岁，术中取病人肝癌组织及癌旁组织（距肿瘤边缘3 cm 以上）。本研究对象或其近亲属签署知情同意书，且经沧州市第三医院伦理委员会审核、批准后实施（批号20140105）。

纳入标准：①确诊肝癌前有HBV 感染史，血清乙型肝炎表面抗原阳性；②均符合《原发性肝癌诊疗规范》中相关标准［12］；③术前未接受过化、放疗及激素治疗等；④临床资料齐全。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②感染其他型肝炎病毒者；③酒精性肝病、药物性肝损伤者；④合并心血管疾病、自身免疫疾病；⑤随访过程中失访者。

1.2 方法

1.2.1样本采集 于术中收集HBV 相关肝癌病人的癌组织及癌旁组织，新鲜的肝组织立即置于液氮中冷冻，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）法检测肝组织中miR-125a-5p、VDR mRNA 水平 将肝组织研磨成组织匀浆，采用TRIzol试剂（德国默克公司，货号MFCD00213058）提取总RNA，使用逆转录试剂盒（德国Qiagen 公司，货号205110）将RNA 逆转录为互补DNA，并以所得互补DNA 为模板，在Taq DNA 聚合酶作用下进行qRT-PCR 反应。miR-125a-5p 反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；VDR mRNA 反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环。miR-125a-5p、VDR mRNA 及相应内参U6、三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的引物序列见表1。

表1 miR-125a-5p、VDR mRNA及相应内参U6、GAPDH的引物序列

采 用2-ΔΔCt法计算miR-125a-5p、VDR mRNA水平。

1.2.3靶向关系预测 使用TargetScan 数据库（http：∕∕www.targetscan.org∕vert_72∕），预测miR-125a-5p与VDR的结合位点。

1.3 随访对所有HBV 相关肝癌病人于手术结束当天开始进行随访，采取门诊、电话或微信等方式，随访结束日期为病人死亡日期或至2021 年5 月31日。

1.4 统计学方法数据采用SPSS 21.0 处理。计量资料均服从正态分布，如miR-125a-5p、VDR mRNA水平等以描述，采用配对样本或独立样本t检验；以例（%）描述计数资料，行χ2检验；Pearson 法分析肝癌组织中miR-125a-5p、VDR mRNA 的相关性；Kaplan-Meier 法绘制HBV 相关肝癌病人生存曲线，行Log-rank 检 验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝组织中miR-125a-5p、VDR mRNA 水平比较肝癌组织miR-125a-5p 水平低于癌旁组织（P＜0.05），VDR mRNA水平高于癌旁组织（P＜0.05）。见表2。

表2 不同肝组织中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、维生素D受体（VDR）mRNA水平比较∕

表2 不同肝组织中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、维生素D受体（VDR）mRNA水平比较∕

2.2 miR-125a-5p、VDR mRNA 水平与HBV 相关肝癌病人临床病理特征的关系不同年龄、性别、肿瘤长径的HBV 相关肝癌病人miR-125a-5p、VDR mRNA 水平比较，均差异无统计学意义（P＞0.05）；门静脉侵袭、淋巴结转移、中高分化及TNM 分期Ⅲ期病人miR-125a-5p水平低于门静脉无侵袭、淋巴结未转移、低分化及TNM 分期Ⅰ～Ⅱ病人（P＜0.05），VDR mRNA水平高于门静脉无侵袭、淋巴结未转移、低分化及TNM分期Ⅰ～Ⅱ病人（P＜0.05）。见表3。

表3 miR-125a-5p、VDR mRNA水平与HBV相关肝癌病人临床病理特征的关系∕

表3 miR-125a-5p、VDR mRNA水平与HBV相关肝癌病人临床病理特征的关系∕

注：miR-125a-5p为微RNA-125a-5p，VDR为维生素D受体，HBV为乙型肝炎病毒。

2.3 肝癌组织中miR-125a-5p、VDR mRNA 的相关性分析经TargetScan 数据库预测，miR-125a-5p与VDR存在相应的结合位点，见图1。

图1 微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）与维生素D受体（VDR）靶向关系预测

HBV 相关肝癌病人肝癌组织中miR-125a-5p 与VDR mRNA呈负相关（r=-0.44，P＜0.001），见图2。

图2 乙型肝炎病毒（HBV）相关肝癌病人肝癌组织中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）与维生素D受体（VDR）mRNA的相关性分析

2.4 miR-125a-5p、VDR mRNA 表达与HBV 相关肝癌病人生存率的关系分别以miR-125a-5p、VDR mRNA 中位数（0.67、1.71）为界将病人分为miR-125a-5p 高表达组（32 例）、低表达组（33 例），VDR mRNA 高表达组（32 例）、低表达组mRNA（33例）。65例HBV 相关肝癌病人5年生存率为52.31%（34∕65），其中miR-125a-5p 高表达组5 年生存率为65.63%（21∕32），miR-125a-5p 低表达组为39.39%（13∕33），两组比较差异有统计学意义（χ2=4.39，P=0.036），见图3。VDR mRNA 高表达组5 年生存率为37.50%（12∕32），VDR mRNA低表达组为66.67%（22∕33），两组比较差异有统计学意义（χ2=6.48，P=0.011），见图4，5。

图3 乙型肝炎病毒相关性肝癌65例中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）高表达组和低表达组的生存曲线

图4 乙型肝炎病毒相关性肝癌65例中维生素D受体（VDR）mRNA高表达组和低表达组的生存曲线

将miR-125a-5p 高表达+VDR mRNA 低表达定义为A 组，miR-125a-5p 低表达+VDR mRNA 高表达定义为B 组，miR-125a-5p 高表达+VDR mRNA 高表达定义为C 组，miR-125a-5p 低表达+VDR mRNA 低表达为D 组，A 组、B 组、C 组、D 组5年生存率分别为69.57%、23.81%、63.64%、60.00%，四组比较差异有统计学意义（χ2=11.96，P=0.008），见图6。

图5 乙型肝炎病毒相关性肝癌65例中不同时间点miR-125a-5p、VDR mRNA高低表达组人数

图6 乙型肝炎病毒相关性肝癌65例中不同微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、维生素D受体（VDR）mRNA表达病人的生存曲线

3 讨论

肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均呈上升趋势［13］。尽管肝癌的致病原因不同，但几乎50% 的肝癌与HBV 感染有关［14-15］。研究表明，HBV X 蛋白是一种多功能调节蛋白，可通过调节细胞因子参与转录激活、表观遗传调控、病毒复制和DNA 修复等过程，从而在肝细胞癌变中发挥关键作用［16-17］。HBV 相关性肝癌发病机制复杂，临床上尚无特效药物［18］，探寻HBV 相关性肝癌的发病机制，寻找相关生物标志物，对该病的诊治有重要意义。

miR-125a-5p在多种癌症中发挥抑癌作用，其通过调节细胞增殖、迁移、转移、侵袭、凋亡参与癌症的发生发展［19-20］。研究发现，卵巢癌细胞株中miR-125a-5p 水平低于正常卵巢细胞，过表达miR-125a-5p 可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，miR-125a-5p 可能通过下调ras 癌基因家族成员Rab3D 表达从而抑制卵巢癌的疾病进展［21］。此外，miR-125a-5p在肾癌组织和细胞中表达下降，其可通过靶向信号转导和转录激活因子3 调控细胞凋亡相关蛋白表达，从而促进肾癌细胞株A498 的凋亡［22］。有关miR-125a-5p 在肝癌中的研究逐渐增加，研究表明，在肝细胞癌中，miR-125a-5p 可通过靶向造血底物1 相关蛋白并同时调节抑癌基因p53、血管内皮生长因子及上皮间质转化相关标志物的表达来抑制肝癌生长［23］。Li 等［24］研究发现，miR-125a-5p 在HBV 相关肝细胞癌中明显下调，miR-125a-5p过表达可显著抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，并降低乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原的分泌。本研究结果与上述结果一致，miR-125a-5p 在HBV 相关肝癌病人组织中表达水平低于癌旁组织，提示miR-125a-5p 表达受抑制，其调节的相关肿瘤基因表达升高，从而参与肝癌的发生发展。且miR-125a-5p 水平与病人门静脉侵袭、淋巴结转移、分化程度及TNM 分期有关，提示miR-125a-5p 水平可能对于预测病人疾病严重程度有一定的作用。

近年来研究发现，维生素D与恶性肿瘤的增殖、分化相关，具有抗肿瘤作用，而维生素D 必须通过VDR 发挥作用，维生素D 可上调多种细胞、组织中的VDR 蛋白水平，但其对VDR mRNA 水平的调节较为复杂，存在组织细胞特异性［25-27］。VDR 为类固醇激素∕甲状腺激素受体超家族的一员，在机体中广泛分布，VDR 可诱导基因调控和细胞信号传导，抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和自噬、调控免疫系统等，从而参与调控肿瘤的发生发展［28-29］。研究发现，肝细胞癌病人癌组织VDR mRNA 水平高于癌旁组织，提示VDR 与肝细胞癌密切相关［30］。上述结果与本研究结果基本一致，且本研究还发现，VDR mRNA 水平与HBV 相关肝癌病人的门静脉侵袭、淋巴结转移、分化程度及TNM 分期有关，提示VDR mRNA 表达与肝癌的发生发展关系密切。此外，有研究表明，miR-125a-5p 与VDR 存在靶向关系，miR-125a-5p 过表达可抑制阿司咪唑诱导的VDR 增加和增强维生素D 的抗肿瘤作用［31］。本研究经TargetScan 数据库预测，发现miR-125a-5p 与VDR 存在相应的结合位点，且相关性分析显示，HBV 相关肝癌病人miR-125a-5p 与VDR mRNA 呈负相关，提示二者可能相互作用，共同影响肝癌的疾病进展。本研究对miR-125a-5p 和VDR mRNA 与肝癌病人生存率的关系进行了探讨，结果显示miR-125a-5p 高表达组5 年生存率高于miR-125a-5p 低表达组，VDR mRNA 高表达组5年生存率低于VDR mRNA 低表达组，miR-125a-5p 高表达+VDR mRNA 低表达病人5年生存率最低，miR-125a-5p 低表达+VDR mRNA 高表达病人5 年生存率最高，提示miR-125a-5p 与VDR mRNA 表达变化与HBV 相关肝癌病人预后有一定关系，监测miR-125a-5p 与VDR mRNA 水平可能有助于预测肝癌病人预后状况，从而能够早期介入治疗，改善病人预后。

综上所述，HBV 相关肝癌病人肝癌组织中miR-125a-5p 表达降低，VDR mRNA 水平增加，二者与病人临床病理特征有关，监测miR-125a-5p 与VDR mRNA水平对于预后评估有一定价值。

（本文图3～6见插图6-9）