CXCL4、MMP-9、miR-24 对急性脑梗死早期神经功能恶化的预测价值

彭国斌 何健萍

周口市第一人民医院（周口 466700）

近年来，我国急性心脑血管事件发生率逐年上升，急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）在心脑事件中属于常见疾病，占脑卒中的70%左右，其发生主要是指脑供血中断，致使脑组织出现死亡，致患者残疾及死亡率均较高。虽然对于ACI治疗药物应用较为广泛，预后情况得到明显改善，但部分患者仍在治疗过程中出现早期神经功能恶化（early neurological deterioration，END），在发病后数小时或数天内，病情出现进行性加重，其发生率占总患者的5%～40%左右，导致患者死亡率直线上升［1-2］。有研究显示［3］。患者预后不良与EDN发生具有联系，因此对ACI后早期EDN预测具有重要价值。CXC趋化因子配体4（CXC chemokine ligand 4，CXCL4）属于趋化因子CXCL成员，其表达与多种心脑血管疾病具有联系［4］。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可破坏血管基底膜，对血-脑脊液屏障结构及功能产生影响。miR对机体多种生理病理反应可进行调控，微小RNA-24（miR-24）可通过对蛋白质编码进行调控，参与机体多种疾病的发生进展［5］。目前，关于CXCL4、MMP-9、miR-24对ACI早期发生END的预测价值的相关报道较少。基于上述研究背景，本研究探讨CXCL4、MMP-9、miR-24对ACI早期发生END的预测价值，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

分别选择2020年1月—2021年6月我院收治的30例ACI早期END患者（ACI+END组），30例ACI患者（ACI组），同期30例健康人群作为对照组。纳入标准：急性脑梗死患者均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南 2018》［6］中相关标准；发病时间＜3 d，精神状态正常、免疫功能正常。排除标准：患有恶性肿瘤，感染性疾病，入院前接受过抗凝治疗，全身重要器官功能性障碍，脑出血。本研究患者均知情，自愿参与，经我院伦理会批件号通过。

END评估标准：入院3 d内，美国国立卫生院神经功能缺损评分（National Institutes of Health Neurological Deficit Score，NHISS）［7］上升2分及以上，出现新的功能缺损。轻度指评分≤16，中度指评分＞16。

1.2 临床资料收集

收集受试者一般资料［年龄、性别、体质量指数（body mass indax，BMI）］、病史（糖尿病、高血压病史、冠心病、高脂血症、房颤、脑卒中等）、颅内动脉狭窄、白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、吸烟史、饮酒史、NHISS评分、实验室指标［总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（total triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high desity cholesterol，高密度脂蛋白胆固醇）、低密度脂蛋白（low desity cholesterol，低密度脂蛋白胆固醇）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）］。

1.3 指标检测

所有受试者采集静脉血5～10 mL，采集条件为清晨空腹状态下，进行离心分离血清，离心条件（3 000 r/min，时间10 min，半径5 cm），置于低温冰箱保存。CXCL4检测方式采用乳胶增强免疫比浊法。MMP-9检测方式采用酶联免疫吸附试验。miR-24检测采用RT-PCR，将标本与TRIzol试剂进行混合、裂解，提取总RNA，引物片段进行扩增，内参基因为U6，进行反转录，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。获取cDNA标本，储存条件为-20 ℃冰箱内，PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min，1个循环；95℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环，均进行3次试验，采取平均值，测Ct值。引物序列：miR-24：正向5'-TGTTCCTGCTGAACTGAGCC-3'，反向5'-CTCTGCCTCCCGTGCCTA-3'；U6：正向5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向5'-CAGGGCCATGCTAATCTT-3'。计算方式选取2-△△Ct法进行。

1.4 统计学处理

SPSS 22.0进行数据分析，应用Kolmogorov-Smirnov检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用F检验，2组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布，经自然对数转换后采用M（Qn）表示采用非参数检验。以率（%）表示计数资料采用χ2检验。CXCL4、MMP-9、miR-24之间相关性采用Pearson分析，采用受试者工作特征（receiver operator characteristics，ROC）曲线分析CXCL4、MMP-9、miR-24急性脑梗死早期神经功能恶化的预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线资料

3组受试者男性比例、年龄、BMI、比较均无差异（P＞0.05），具有可比性。ACI+END组、ACI组患者白细胞计数、TC、LDL-C、hs-CRP、Fg高于对照组（P＜0.05）。与DM组比较，ACI+END组患者合并糖尿病、吸烟史、NHISS评分、白细胞计数、TC、LDL-C、hs-CRP、Fg水平更高，比较差异具有统计学意义（P＜0.05），2组性别、年龄、BMI、高血压病史、高血脂、脑卒中、冠心病、房颤、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、PFG、颅内动脉狭窄、TG、HDL-C、饮酒史比较均无统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 基线资料 ［n=30，n（%），±s ］

表1 基线资料 ［n=30，n（%），±s ］

注：与对照组比较 aP＜0.05，与ACI组比较 bP＜0.05

项目 ACI+END 组 ACI 组 对照组 F/t/ χ2 P男性 21（70.00） 18（60.00） 19（63.33） 0.439 0.626平均年龄/岁 60.32±7.71 60.06±6.18 60.99±7.52 0.590 0.463 BMI/（kg/m2） 25.24±2.01 25.50±1.85 25.16±1.37 0.337 0.715高血压病史 17（56.67） 16（53.33） / 0.067 0.795糖尿病病史 19（63.33） 8（26.67） / 8.148 0.004高血脂 12（40.00） 10（33.33） / 0.287 0.592脑卒中 14（46.67） 15（50.00） / 0.067 0.796冠心病 6（20.00） 5（16.67） / 0.111 0.099房颤 12（40.00） 13（43.33） /白细胞计数/（×109/L） 9.65±1.21ab 6.21±1.02a 2.21±0.74 49.770 0.001中性粒细胞计数/（×109/L） 4.74±0.32 4.51±0.36 4.32±0.33 8.669 0.001淋巴细胞计数/（×109/L） 1.99±0.32 2.01±0.36 2.13±0.30 3.029 0.031 FPG/（mmol/L） 4.01±0.12 4.16±0.15 4.12±0.23 4.023 0.006颅内动脉狭窄 13（43.33） 11（36.67） / 0.069 0.123 TC/（mmol/L） 5.09±0.36ab 4.54±0.41a 3.23±0.51 28.260 0.001 TG/（mmol/L） 1.19±0.21 1.16±0.20 1.13±0.31 1.520 0.209 HDL-C/（mmol/L） 1.12±0.25 1.10±0.29 1.16±0.32 0.935 0.357 LDL-C/（mmol/L） 3.36±0.56ab 2.29±0.15a 1.35±0.09 33.615 0.001吸烟史 19（63.33） 8（26.67） / 8.148 0.004饮酒史 12（40.00） 14（46.67） / 0.271 0.602 hs-CRP/（mg/L） 4.84±0.45ab 1.57±0.38a 0.54±0.11 88.065 0.001 NHISS/分 11.68±2.42b 6.53±1.41 / 11.630 0.001 Fg/（g/L） 3.32±0.51a 3.30±0.58a 1.54±0.31 28.290 0.001

2.2 CXCL4、MMP-9、miR-24表达比较

CXCL4、MMP-9水平在对照组、ACI组、ACI+END组中依次升高，miR-24相对表达量依次降低，各组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同分组CXCL4、MMP-9、miR-24表达差异 （±s ）

表2 不同分组CXCL4、MMP-9、miR-24表达差异 （±s ）

注：与对照组比较 aP＜0.05，与ACI组比较 bP＜0.05

组别 n CXCL4（ng/mL） MMP-9（μg/L） miR-24对照组 30 5.22±1.35 403.83±23.25 3.26±0.11 ACI 组 30 11.12±2.65a 854.62±36.31a 1.62±0.57a ACI+END 组 30 16.56±3.62ab 1021.64±44.49ab 1.06±0.19ab F 24.450 103.83 84.960 P 0.001 0.001 0.001

2.3 不同神经功能缺损程度CXCL4、MMP-9、miR-24表达比较

血清CXCL4、MMP-9、miR-24表达在轻度、重度患者中呈升高趋势，miR-24相对表达呈降低趋势，各组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同神经功能缺损程度CXCL4、MMP-9、miR-24表达差异 （±s ）

表3 不同神经功能缺损程度CXCL4、MMP-9、miR-24表达差异 （±s ）

组别 n CXCL4（ng/mL） MMP-9（μg/L） miR-24轻度 17 14.22±1.37 995.83±31.26 1.46±0.14重度 13 17.86±3.52 1121.64±47.89 1.01±0.12 t 3.911 7.646 9.267 P 0.001 0.001 0.001

2.4 ACI患者发生END的因素分析

以ACI患者是否发生END为因变量（0=否，1=是），吸烟史、糖尿病史、NHISS评分、白细胞计数、TC、LDL-C、hs-CRP、Fg、CXCL4、MMP-9、miR-24为自变量，建立Logistic回归模型，并校正年龄、性别等混杂因素影响，最终LDL-C、TC、NHISS评分、CXCL4、hs-CRP、MMP-9、miR-24是ACI患者并发END的危险因素，见表4。

表4 ACI患者发生END的Logistic回归分析

2.5 CXCL4、MMP-9、miR-24之间相关性分析

经过Pearson相关性分析发现，CXCL4与MMP-9之间呈正相关（r=0.584，P=0.001）；CXCL4、miR-24之间呈负相关（r=-0.569，P=0.001）；MMP-9、miR-24之间呈负相关（r=-0.567，P=0.001），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 CXCL4、MMP-9、miR-24 之间相关性分析

2.6 血清CXCL4、MMP-9、miR-24对急性脑梗死早期神经功能恶化的预测价值

ROC曲线显示，与CXCL4、MMP-9、miR-24单项预测相比，三项联合检测对急性脑梗死早期神经功能恶化的预测价值较高（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 血清CXCL4、MMP-9、miR-24 对急性脑梗死早期神经功能恶化的预测价值

表5 血清CXCL4、MMP-9、miR-24诊断急性脑梗死早期神经功能恶化的效能分析

3 讨 论

保证ACI患者预后情况，需对END的发生进行早期判断，尽早进行干预，可有效阻止不良脑血管恶性事件的发生。血清指标在多种疾病的诊断、预测中具有重要价值，准确性较为理想，方便快捷。随着对ACI发病机制不断进行研究实验，炎症反应在ACI后神经损伤有着较为重要的影响，可促进脑损伤的进展，可能发展为END［8-9］。

趋化因子可对不同种类的细胞进行趋化效应，在机体多种生理病理过程中发挥作用，可作为动脉粥样硬化斑块形成的介质，CXCL4所属CXC亚家族，在神经系统疾病发生及发展中扮演重要角色，CXCL4可随着血小板活化，释放进入血液［10］。有学者研究显示［11］，CXCL4在动脉粥样硬化早期形成已沉积，其表达水平与其病变程度具有显著关联，在ACI发病进程中具有一定价值。MMP-9属于金属依赖性蛋白酶，由于ACI致使机体炎症反应加剧，促进MMP-9大量形成，患者血清中MMP-9水平呈现异常升高的趋势，加重疾病进展，破坏屏障的完整性，出现神经功能损害［12-13］。miR可对mRNA降解进行加强，对编码RNA翻译进行抑制，调控基因相对表达量，与器官组织发育关系密切［14］。有研究显示［15］，脑灌注缺血再灌注模型大鼠miR-24表达呈现异常升高的趋势，miR-24可通过对一氧化氮合酶等指标进行调控，减小梗死面积。miR-24可以对低氧致神经细胞凋亡进行抑制，若细胞凋亡不充足，有可能会出现脑梗死等疾病，需避免缺血、缺氧，减轻神经细胞凋亡。

本研究结果显示，CXCL4、MMP-9水平在对照组、ACI组、ACI+END组中依次升高，miR-24相对表达量依次降低，且CXCL4、MMP-9、miR-24表达在神经功能恶化程度轻度、重度患者中呈升高趋势，miR-24相对表达呈降低趋势。Logistic回归分析得出，血清CXCL4、MMP-9、miR-24异常表达是ACI患者并发END的危险因素，上述研究结果得出，CXCL4、MMP-9表达与患者病程严重程度呈正相关，miR-24表达呈负相关，共同参与参与ACI的发生发展，其原因可能是CXCL4在动脉粥样硬化中发挥促进作用，通过cAMP/PKAI信号传导途径及多种信号通路，影响动脉粥样硬化斑块稳定度，可能会出现斑块破裂的情况，使得ACI病情加重，神经功能出现损伤，诱发END的出现［16-17］。另外，NHISS评分升高及hs-CRP表达异常也是造成ACI后END的相关因素，与以往学者研究结果一致。因此ACI组患者CXCL4、MMP-9表达的升高及miR-24的表达反映了神经缺损严重程度，具有较高的预测价值。相关性分析显示，CXCL4与MMP-9之间呈正相关（r=0.584，P=0.001）；CXCL4、miR-24之间呈负相关（r=-0.569，P=0.001）；MMP-9、miR-24之间呈负相关（r=-0.567，P=0.001）。进一步实施R O C 曲线分析，结果显示，与CXCL4、MMP-9、miR-24单项预测相比，三项联合对ACI的关系及对患者发生的早期END的预测价值较高，三项联合诊断的AUC为0.800，说明联合监测CXCL4、MMP-9、miR-24表达对预测早期END的发生有较好临床价值，对及时干预治疗和改善预后具有正面影响［18］。

综上可知，CXCL4、MMP-9、miR-24在ACI患者发生早期END中表达出现异常变化，三者之间具有一定的相关性，检测CXCL4、MMP-9、miR-24水平对ACI早期END具有一定预测价值，尽早制定相关措施干预，降低不良预后的发生概率。