喉鳞状细胞癌组织中SEPT2、CMTM6表达及其与化疗敏感性的关系*

武川军,彭丽娜,冯志星,韩海平

邯郸市中心医院耳鼻咽喉科,河北邯郸 056002

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,2020年世界卫生组织统计显示,全球喉癌新发和死亡病例分别为18.46万例、9.98万例,中国喉癌新发和死亡病例分别为2.91万例、1.58万例,疾病负担严重[1]。喉鳞状细胞癌(LSCC)是喉癌最常见的类型,目前手术和放化疗仍然是LSCC的主要治疗策略,但LSCC发病机制复杂导致治疗疗效受到严重限制[2]。因此,了解LSCC发生的分子机制,对LSCC治疗和预后评估至关重要。有研究表明,细胞骨架改变和免疫逃逸参与肿瘤发生发展[3-4]。胞裂蛋白2(SEPT2)是公认的细胞骨架调节的重要参与者[5]。含CKLF样MARVEL跨膜结构域的蛋白6(CMTM6)是新近发现的一种共刺激分子,能增强免疫抑制促进肿瘤免疫逃逸[6]。已有研究报道,SEPT2、CMTM6在LSCC患者中表达上调[7-8]。然而,关于SEPT2、CMTM6表达与LSCC化疗敏感性的关系尚不清楚。本研究探讨LSCC组织中SEPT2、CMTM6表达,以及与化疗敏感性的关系,旨在为LSCC的靶向治疗和化疗方案选择提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2019年8月本院收治的117例LSCC患者作为研究对象。纳入标准:(1)经病理检查确诊为LSCC;(2)年龄≥18岁;(3)初诊且喉次全切除术或喉全切除术后行化疗治疗;(4)临床资料完整。排除标准:(1)喉转移瘤或合并其他部位恶性肿瘤;(2)入院前接受过抗肿瘤治疗或术前行放化疗;(3)医院内死亡;(4)合并全身性感染性疾病和血液系统、免疫系统疾病;(5)拒绝接受随访。本研究经医院伦理委员会批准,所有患者或家属知情并签署知情同意书。LSCC患者一般资料见表1。

表1 117例LSCC患者一般资料

1.2方法 所有患者均先行手术治疗,术中留取部分癌组织和癌旁组织,以生理盐水清晰后于液氮保存,术后按照《喉癌外科手术及综合治疗专家共识》[10]接受TP方案(紫杉醇+顺铂)化疗。取出冻存组织研磨成末,按照Trizol试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)说明书提取组织中总RNA,琼脂糖电泳确认RNA纯度后再按照Takara逆转录试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)说明书将2 μg RNA逆转录为cDNA。按照荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(北京百迈客生物科技有限公司)说明书配制PCR反应体系(20.0 μL):cDNA模板1.0 μL、2×Master mix 8 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL、RNase-free ddH2O 5.0 μL。SEPT2引物:正向5′-CGTGGAGAAGAATTGGGC-3′,反向5′-CGTGGAGAAGAATTGGGC-3′;CMTM6引物:正向5′-AGGCAATAGGTCAGTAAGGTCAGTAGG-3′,反向5′-GTCCAGAAGCAGTCAGTCTCAAGTC-3′;内参GAPDH引物:正向5′-AGATCTCCAGTGGCTGG-3′,反向5′-TAGGGACATGATATGCTGT-3′。于LightCycler 440型RT-qPCR仪(瑞士罗氏公司)上进行PCR反应,反应条件:95 ℃ 10 min,1个循环,95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s,45个循环。记录Ct值,以2-ΔΔCt法计算组织中SEPT2、CMTM6的mRNA相对表达水平。

1.3观察指标 (1)疗效评价:根据文献[11]评价。完全缓解:所有病灶消失;部分缓解:病灶直径总和缩小≥30%,维持>4周;疾病稳定:病灶直径总和缩小<30%,增加<20%,维持>4周;疾病进展:病灶直径总和增加≥20%或出现新病灶。(2)随访:患者出院后通过门诊或电话随访3年,统计患者生存情况。根据LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达均值分为SEPT2 mRNA高表达组和SEPT2 mRNA低表达组、CMTM6 mRNA高表达组和CMTM6 mRNA低表达组,比较不同SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达LSCC患者客观缓解率和生存情况。

2 结 果

2.1LSCC组织与癌旁组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达比较 LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA相对表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。见表2。

表2 LSCC组织与癌旁组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达比较

2.2LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达与临床病理特征的关系 SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达与LSCC的TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05),与性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤最大径和分化程度无关(P>0.05)。见表3。

表3 LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达与临床病理特征的关系

2.3LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达与化疗敏感性的关系 根据LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达水平均值分为SEPT2 mRNA高表达组(≥1.18,n=56)和SEPT2 mRNA低表达组(<1.18,n=61)、CMTM6 mRNA高表达组(≥1.86,n=54)和CMTM6 mRNA低表达组(<1.86,n=63),结果显示,SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA高表达组的客观缓解率低于SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA低表达组(P<0.05)。见表4、5。

表4 不同SEPT2 mRNA表达LSCC患者客观缓解率比较[n(%)]

2.4LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达与预后的关系 117例LSCC患者随访4～36个月,失访5例,死亡29例,3年总生存率为75.21%(88/117)。K-M生存曲线分析显示,SEPT2 mRNA高表达组总生存率[66.07%(37/56)]低于SEPT2 mRNA低表达组[83.61%(51/61)];CMTM6 mRNA高表达组总生存率[66.67%(36/54)]低于CMTM6 mRNA低表达组[82.54%(52/63)],差异有统计学意义(Log-rankχ2=5.571、5.107,P=0.018、0.024)。见图1。

表5 不同CMTM6 mRNA表达LSCC患者客观缓解率比较[n(%)]

3 讨 论

喉癌是起源于喉黏膜上皮组织的恶性肿瘤,其中90%以上为LSCC,由于喉部与人的外貌、营养和社交互动等密切相关,因此LSCC不仅会影响患者寿命,还可因喉部结构损害和功能障碍降低患者生命质量[12]。化疗是LSCC治疗中不可或缺的手段,然而临床实践中部分患者对化疗药物耐药、继发耐药和化疗抵抗,导致LSCC治疗失败和预后不良[13],研究LSCC化疗敏感性的发生机制对指导筛选患者人群和提高化疗效果具有重要意义。

SEPT家族是一类介导细胞骨架网络的组织和动力学调控的GTP酶,SEPT2是SEPT家族重要成员,能与肌动蛋白形成螺旋式或圈形的纤维束,维持肌动蛋白束中稳定性,当细胞骨架损伤引起肌动蛋白组装活跃时,SEPT2与肌动蛋白分裂后会影响肌动蛋白稳定性,导致细胞骨架异常[14-15]。基于SEPT2对细胞骨架间的重要作用,近年多项研究报道了SEPT2与结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤的关系[16-17]。本研究结果显示,LSCC组织中SEPT2 mRNA表达上调,这与既往研究报道一致[7],分析原因可能是LSCC细胞骨架异常改变导致肌动蛋白组装活跃,引起SEPT2与肌动蛋白分裂,促进SEPT2表达。本研究结果还显示,LSCC组织中SEPT2 mRNA表达与TNM分期和淋巴结转移有关,同时SEPT2 mRNA高表达组客观缓解率显著降低,提示SEPT2 mRNA高表达参与LSCC发展,与化疗敏感性降低有关。

CMTM6是CMTM超家族成员,主要表达于免疫器官,能通过结合PD-L1防止其被靶向降解,增强免疫系统抑制,帮助肿瘤细胞免疫逃逸[18]。本研究结果显示,LSCC组织中CMTM6 mRNA表达上调,分析与肿瘤激活CMTM6启动免疫逃逸有关,与既往报道结果一致[8]。本研究结果还显示,LSCC组织中CMTM6 mRNA表达与TNM分期和淋巴结转移有关,同时CMTM6 mRNA高表达组客观缓解率显著降低,提示CMTM6 可能参与LSCC的发展,与化疗敏感性降低有关。本研究通过随访发现,SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA高表达患者3年总生存率显著降低,提示SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA表达与LSCC患者预后有关,二者可能作为LSCC患者预后潜在预测指标。

综上所述,LSCC组织中SEPT2 mRNA、CMTM6 mRNA高表达与临床病理特征、化疗敏感性和预后有关,但本研究结果还需多中心研究证实。