二次移植成功治疗急性白血病单倍体造血干细胞移植植入失败

黄克智 李益清 谢少凡 肖洁 杨文娟 谢双锋 马丽萍 聂大年

造血干细胞移植是有望治愈急性白血病、遗传代谢性疾病等的有效手段[1-3]。随着移植技术的进步，单倍体造血干细胞移植正成为主要移植方式之一[4-6]。植入失败是单倍体造血干细胞移植少见、严重甚至致命的并发症[7-8]。二次移植是治疗植入失败的公认有效策略，然而，植入失败的原因、二次移植的供者选择、预处理方案等仍有待进一步研究。本研究报道了2 例急性白血病单倍体造血干细胞移植植入失败的患者，采用二次移植成功治疗植入失败，受者获得良好生存，报道如下。

1 临床资料

例1，男，42 岁。2018年8月因“头晕、心悸”入院，当地查外周血白细胞4.02×109/L，红细胞1.30×1012/L，血红蛋白40 g/L，血小板21×109/L，骨髓细胞学检查考虑骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS），地中海贫血基因检测提示41-42 位点杂合突变的β 地中海贫血。予地西他滨（decitabine）+阿糖胞苷（cytarabine）+阿克拉霉素（aclacinomycin）+粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）化学药物治疗（化疗），化疗第10日转至中山大学孙逸仙纪念医院，最终诊断为“急性髓系白血病；β 地中海贫血”，予以4 次化疗（图1）。

患者于2019年3月进行首次单倍体造血干细胞移植，供者为次子，19 岁，人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）7/10 相合，供者和受者血型分别为O 型和A 型，供者伴β 地中海贫血。供者外周血红细胞6.03×1012/L，血红蛋白115 g/L，红细胞平均体积63.3 fl，红细胞平均血红蛋白含量19.1 pg，红细胞平均血红蛋白浓度301 g/L，呈小细胞低色素性贫血。受者的供者特异性抗体（donor specific antibody，DSA）阴性。预处理采用白消安（busulfan，Bu）+环磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）+抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）方案，供者外周血干细胞（peripheral blood stem cell，PBSC）动员采用G-CSF，受者移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）预防采用环孢素（ciclosporin，CsA）+ 吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）+短程甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）（图1）。由于PBSC 采集不理想，在供者动员第4～6日，共进行了3 次PBSC 采集，共获得有核细胞7.84×108/kg、单个核细胞7.38×108/kg，CD34+细胞2.57×106/kg。+15 d 中性粒细胞、血小板植入。

+82 d，患者外周血白细胞0.51×109/L，中性粒细胞0.26×109/L，血红蛋白59 g/L，血小板11×109/L，骨髓微小残留病灶阴性，短串联重复序列（short tandem repeats，STR）检测结果显示细胞59%为供者型，考虑继发植入失败。予以减停免疫抑制药、刺激造血，并采用阿托伐他汀、乙酰半胱氨酸促进骨髓间充质干细胞生长等措施，+97 d 输注脐带血（男，HLA 5/6 相合，血型O 型，有核细胞2.67×107/kg，CD34+细胞1.42×105/kg）、间充质干细胞1×107个，+100 d 输注供者（次子）动员后的PBSC，含单个核细胞2.1×108/kg，CD34+细胞0.72×106/kg。+114 d 骨髓微小残留病灶阴性，STR 检测结果显示细胞0%为次子供者型，24.93%为脐带血供者型。+117 d患者高热，血培养肺炎克雷伯菌阳性，降钙素原48.57 ng/mL。在此期间患者外周血白细胞（0.11～0.35）×109/L，血红蛋白53～73 g/L，血小板（5～32）×109/L，继续予支持对症治疗。

2019年8月行二次移植（+146 d），供者为长子，23 岁，HLA 7/10 相合，供者和受者血型分别为O 型和A 型，供者血常规、骨髓形态、染色体无异常，受者DSA 阴性。预处理采用减低剂量氟达拉滨（fludarabine，Flu）+Bu+ATG 方案（图1）。输注第二供者PBSC，含有核细胞16.24×108/kg，单个核细胞10.94×108/kg，CD34+细胞4.28×106/kg。二次移植+10 d 血小板植入，+12 d 中性粒细胞植入。多次随访（末次随访时间为二次移植+1 062 d）血常规基本正常，骨髓细胞形态学提示白血病完全缓解，微小残留病灶阴性，STR 检测结果提示细胞100%为长子供者型，期间曾有肺部、软组织感染，治疗后好转，无GVHD 等并发症。

图1 例1 患者治疗全过程Figure 1 Treatment procedure of patient 1

例2，男，15 岁。2021年5月因“腹痛12日，发热2日”就诊于中山大学孙逸仙纪念医院，外周血白细胞58.97×109/L，红细胞2.69×1012/L，血红蛋白84 g/L，血小板93×109/L，最终诊断为急性淋巴细胞白血病，予以5 次化疗（图2）。期间伴肺部真菌感染，使用三唑类抗真菌治疗。

2021年10月行首次单倍体造血干细胞移植，供者为胞姐，23 岁，HLA 8/10 相合，地中海贫血SEA 基因杂合缺失，供者和受者血型分别为A 型和AB 型。供者外周血红细胞5.50×1012/L，血红蛋白122 g/L，红细胞平均体积71.6 fl，红细胞平均血红蛋白含量22.2 pg，红细胞平均血红蛋白浓度310 g/L，呈小细胞低色素性贫血。受者DSA 阴性。预处理方案为Bu+Flu，GVHD 预防采用环孢素+吗替麦考酚酯+移植后Cy（post-transplant Cy，PTCy ）（图2）。两日内共输注PBSC 含有核细胞26.36×108/kg，单个核细胞10.19×108/kg，CD34+细胞1.99×106/kg。+13 d 中性粒细胞、血小板植入。+18 d 开始患者出现血象三系进行性下降，+24 d 骨髓增生减低，微小残留病灶阴性，STR 检测结果提示细胞84%为供者型，予刺激造血、改善造血微环境等处理后，血象无好转，三系进一步下降，需要依赖血制品输注。+30 d血白细胞0.16×109/L，中性粒细胞0.02×109/L，血红蛋白69 g/L，血小板14×109/L，考虑植入失败。

2021年11月行二次移植（首次单倍体造血干细胞移植+39～40 d），供者为胞妹，12岁，HLA 5/10相合，供受者血型均为AB 型，供者血常规正常。预处理方案为Flu+Bu+ATG（图2）。输注第二供者PBSC，含有核细胞33.9×108/kg，单个核细胞17.46×108/kg，CD34+细胞5.75×106/kg。二次移植+10 d 中性粒细胞、血小板植入。多次随访（末次随访时间为二次移植+265 d）血白细胞（2.36～6.46）×109/L，血红蛋白、血小板基本正常，骨髓微小残留病灶阴性，STR 检测结果提示细胞100%为第二供者型。期间曾有轻度血转氨酶升高、轻度慢性GVHD（皮肤、肺），治疗后好转。

图2 例2 患者治疗全过程Figure 2 Treatment procedure of patient 2

2 讨论

当前，单倍体造血干细胞移植治疗急性白血病的例数日益增多[9-10]，植入失败等并发症亦需重视[11-16]。本文分析2 例急性白血病单倍体造血干细胞移植植入失败，发现2 例供者均伴有地中海贫血，导致PBSC采集困难，CD34+细胞数量偏少，是植入失败的重要原因。重要的是，2 例植入失败患者均及时进行二次移植，移植物成功植入，患者获得良好生存。

2.1 植入失败的原因

按照欧洲骨髓移植协会（European Society for Blood and Marrow Transplantation，EBMT） 植入标准[17]，连续3 d 中性粒细胞计数＞0.5×109/L 为粒细胞植入；连续7 d 不输注血小板，血小板≥20×109/L为血小板植入。原发性植入失败为骨髓或外周造血干细胞移植+28 d，中性粒细胞、血小板未达植入标准；继发性植入失败为植入成功后，再次出现三系或两系血细胞下降或供受者嵌合状态＜5%，并排除疾病复发、感染、药物等因素[18]。

最近，Man 等[19]提出了移植物功能不良的“种子-土壤-害虫”理论学说。作为“种子”的CD34+细胞，很多移植中心通常要求最低限度是2.0×106/kg，而EBMT 则推荐5.0×106/kg 是更优的剂量。据报道，CD34+细胞＜3.0×106/kg，植入失败率可达12%[20]。本研究中2 例植入失败患者首次移植的CD34+细胞分别为2.57×106/kg 和1.99×106/kg，均偏少，是植入失败的重要因素。究其原因，2 例供者均伴有地中海贫血，PBSC 总采集天数分别为3 d、2 d，最终总CD34+细胞数量仍偏少。伴地中海贫血的供者是否符合移植要求，目前未有定论。据报道，供者伴地中海贫血确实会影响PBSC 采集，但通过调整采集参数、增加采集次数，仍然可以收获足量PBSC，并成功植入，不影响造血重建[21-24]。

地中海贫血对干细胞采集的影响与血细胞分离机工作原理有关。目前常用的血细胞分离机属于连续流动离心式设备，根据血液各成分的不同比重进行分离，离心后血液各成分密度从小至大分别是血浆、血小板、白细胞和红细胞，干细胞密度接近白细胞中的淋巴细胞、单核细胞。Sanford 等[22]指出，地中海贫血供者平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度减小，红细胞密度减小，与干细胞密度差值缩小（红细胞密度甚至低于干细胞），因此干细胞更容易沉积在红细胞层，导致原本在正常吸取干细胞层的位置吸取不到足量的干细胞。这种情况下，建议调整机器参数在更深（密度更大）的位置吸取干细胞。另外，地中海贫血供者红细胞大小分布和密度范围相对更广、更不均匀，离心过程不能形成坚固的支撑层，不能形成有效的屏障支撑干细胞，因此建议加大离心速度。我们对2 例伴地中海贫血供者的PBSC 采集参数也进行了调整，但未能取得理想效果。地中海贫血者红细胞血红蛋白量减少，密度降低，使得低密度的干细胞更容易沉积至红细胞层，降低干细胞采集率。为提高采集率，参数调整包括下移干细胞采集层位置，加大离心速度等[22]。

除了CD34+细胞数量偏低，骨髓造血微环境受破坏、DSA 阳性、移植前疾病未缓解、病毒感染、多次输血、GVHD 等均是植入失败的重要因素[14,18-19,25-27]。

2.2 二次移植治疗植入失败

植入失败的治疗措施包括停用毒性药物（如环磷酰胺、甲氨蝶呤等）、调整免疫抑制药、应用造血刺激因子、备存的自体干细胞解救、间充质干细胞输注、供者淋巴细胞输注、二次移植等[18,28]，其中二次移植是公认的有效手段。

在采取了多种措施无效后，我们对植入失败患者进行了二次移植。在供者选择上，二次移植可采用首次移植的供者，或者合适的其他供者[9]。考虑到首次移植的供者伴有地中海贫血，采集的PBSC 数量偏少，笔者中心选择了另外的单倍体供者。预处理方案采用了非清髓性的Flu+Bu+ATG 方案，理由包括：（1）经过首次移植预处理对骨髓造血微环境的损伤，若再次使用清髓性预处理可能会加重机体创伤，对后续移植物归巢、植入、分化等产生负面影响；（2）结合既往文献资料，二次移植多采用Flu 或ATG 为基础的减低强度预处理[29-31]，效果良好。Nagler 等[32]采用Flu+Bu+ATG 减低强度预处理行二次移植，治疗11 例首次移植后复发或继发其他肿瘤的恶性血液病，移植物均成功植入，生存率较高且无明显并发症。笔者认为，Flu 和ATG 的强效免疫抑制作用，使受者T 淋巴细胞对供者造血干细胞产生免疫耐受，有利于干细胞植入。结果显示，2 例患者均对二次移植的Flu+Bu+ATG 预处理耐受性良好，+10 d 血小板植入，+10～12 d 中性粒细胞植入。

目前，二次移植治疗首次移植植入失败的报道不多，尤其是二次移植均采用单倍体供者并获得成功则更为少见。顾斌等[33]对1 例急性髓系白血病单倍体造血干细胞移植（供者为父亲）原发植入失败采用了二次移植（供者为胞姐），未能成功植入，患者8 个月后死于肺部感染。张競文等[34]对1 例急性淋巴细胞白血病单倍体造血干细胞移植（供者为胞妹）植入失败后进行了二次移植（供者为父亲），二次移植前没有预处理化疗，而采用PTCy 为基础的方案预防GVHD。+12 d 中性粒细胞植入，+67 d 血小板植入，移植后临床状况改善，但一年半后患者死于白血病复发。Giammarco 等[35]对19 例单倍体造血干细胞移植植入失败的患者进行了二次移植，其中13 例采用首次移植的供者，6 例更换为新供者。结果显示，74%的患者获得了三系重建，一年生存率66%。多因素分析提示，Bu减量可能是原发植入失败的高危因素。另有6 例急性白血病儿童，原发植入失败后进行了二次移植，均采用Flu+ATG 为基础的预处理方案。其中1例早期死亡，5例中性粒细胞和血小板均成功植入。中位随访时间6.8年，4 例存活者仍处于疾病缓解状态[31]。

与上述研究相比，本研究的2 例二次移植均成功植入，并获得良好生存。既往笔者中心也曾对1 例慢性粒细胞白血病移植后植入失败进行了二次移植，受者获得了长期生存[36]。笔者中心的经验表明，在充分优化预处理方案、供者选择等移植流程时，二次移植治疗植入失败是有效、安全的。

但是，本研究仍存在不足：首先是2 例患者首次移植时，供者均伴有地中海贫血，虽经过充分沟通，患方仍坚持选择地中海贫血供者，导致PBSC 采集困难，即使调整了采集参数，获取的CD34+细胞数量仍偏少，一定程度上诱发了植入失败；其次是二次移植例数仅有2 例，随访时间仍相对较短。今后笔者将在供者选择、干细胞采集流程进一步优化，并继续对二次移植受者进行长期随访，同时增加观察例数。

综上所述，减低剂量预处理的二次移植能够成功治疗急性白血病首次单倍体造血干细胞移植植入失败。