人脐带间充质干细胞来源外泌体在肾缺血-再灌注损伤中的保护作用及其机制研究

郭文文 袁圆 王浩 罗豪 魏华锋 李灵玉 吕兴华

肾缺血- 再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是引起急性肾损伤的主要原因之一，发生在肾移植、肾动脉狭窄、部分肾切除术期间，可导致移植物功能延迟恢复、多器官功能障碍等严重后果，病死率极高[1-2]。肾IRI 发病机制复杂，涉及凋亡、坏死、氧化应激、炎症、线粒体功能障碍等[3-4]。新近研究发现，坏死性凋亡存在于肾IRI的病理损伤过程，抑制坏死性凋亡可能是减轻肾IRI 的方法之一[5-6]。瞬时受体电位阳离子通道蛋白（transient receptor potential canonical，TRPC）6 是一种非选择性Ca2+渗透性阳离子通道，TRPC6 可通过下游聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PARP）1 作用抑制肾小管上皮细胞坏死性凋亡，减轻肾IRI[7]。研究表明，人脐带间充质干细胞来源外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosome，hucMSC-Exo）可通过抑制坏死性凋亡来减轻肾IRI[8]，然而具体信号通路尚不清楚。因此，本研究采用超速离心法提取hucMSCExo，研究其在肾IRI 中的保护作用，进一步评价TRPC6/PARP1 信号通路在hucMSC-Exo 减轻肾IRI中的作用，为治疗肾IRI 提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

30 只雄性健康无特定病原体（specific pathogen free，SPF） 级SD 大鼠，体质量200～250 g，购于兰州大学动物实验中心。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hucMSC）购自商城北纳创联生物科技有限公司。本研究获兰州大学第一医院伦理委员会批准（审批号：LDYYLL2022-399）。

TRPC6 抑 制 剂SKF96365 购 于 美 国MedChemExpress 公司，胎牛血清、培养基、0.25 %胰蛋白酶购于上海逍鹏生物科技有限公司，BCA 蛋白定量试剂盒、血清肌酐和血尿素氮检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，CD9、CD63 抗体购于美国Proteintech 公司；CD81 抗体购于美国ABclonal公司，兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 抗体、β-actin抗体购于美国Abcam 公司；受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1、混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed-lineage kinase domainlike protein，MLKL）抗体购于美国Affinity 公司；RIPK3、TRPC6、PARP1 抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 动物分组与处理

采用随机数表法将大鼠分成5 组：假手术组（S 组）、假手术+TRPC6 抑制剂SKF96365 组（SS 组）、肾IRI 组（IRI 组）、外泌体处理组（EXO 组）、外泌体+TRPC6 抑制剂SKF96365 组（ES 组），每组6 只。

建立肾IRI 模型：将大鼠麻醉后，俯卧位固定，备皮，0.5%碘伏消毒，在背部两侧行1～2 cm 切口，游离出双侧肾脏并找到双侧肾蒂，用无创动脉夹夹闭双侧肾蒂，肾脏由红色转为紫黑色，代表肾血管阻断成功。用生理盐水浸湿的纱布覆盖切口，45 min 后松开动脉夹，观察肾脏迅速由紫黑色转为红色，说明再灌注成功。S 组和SS 组只游离双侧肾蒂，不进行夹闭。SS 组游离双侧肾蒂前5 min 尾静脉注射SKF96365 1.5 mg/kg；S 组和IRI 组注射200 µL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）；EXO 组和ES 组在夹闭双侧肾蒂前15 min 将20 µg 外泌体溶液（20 µg 外泌体稀释于200 µL PBS）随机注射到左肾的5 个部位[9-10]；ES 组夹闭肾蒂前5 min 尾静脉注射SKF96365 1.5 mg/kg[11]。再灌注24 h 后麻醉大鼠，左心室取血及留取肾组织后颈椎脱臼处死大鼠。留取大鼠血液标本于EP 管中，于室温静置1 h 后，4 ℃离心15 min，取上层血清；大鼠部分肾组织用4 %多聚甲醛固定，常温保存，另一部分保存于-80 ℃冰箱。

1.3 实验方法

1.3.1 人脐带间充质干细胞的培养 将hucMSC 接种于培养瓶中，加入适量含10 %胎牛血清和1 %青链霉素的培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。细胞融合度达到80%～90 %时，以1∶3 比例传代。

1.3.2 外泌体的提取与鉴定 取生长良好的3～8 代hucMSC，待细胞融合度达到80%～90%时更换为无血清培养基，培养48 h 后收集细胞上清液，将上清液进行梯度离心，所得贴于试管底壁淡黄沉淀物即为外泌体，用1 mL PBS 轻柔充分地吹打混匀，使外泌体充分重悬，保存于-80 ℃冰箱内备用。

通过透射电子显微镜（透射电镜）观察外泌体形态、用纳米颗粒追踪分析检测外泌体粒径分布范围。BCA 法测蛋白含量，通过蛋白质印迹法检测CD9、CD63 和CD81 蛋白表达。

1.3.3 血清肌酐和血尿素氮检测 血清样本按照试剂盒说明，分别检测各组血清肌酐和血尿素氮水平。

1.3.4 病理学检查 大鼠肾组织用4 %多聚甲醛固定，行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，观察小鼠肾脏病理学变化，在光镜下（×400）随机选取10 个视野观察肾小管损伤程度，并采用Paller 评分法评估[12]。

1.3.5 蛋白质印迹法检测 采用蛋白质印迹法检测RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6、PARP1 的表达。将肾组织充分裂解后，4 ℃离心，取上清，严格按照BCA 说明书进行各组蛋白浓度测定。电泳，蛋白转膜、封闭，分别加入稀释好的 RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6、PARP1 一抗液，4 ℃孵育过夜。室温下二抗孵育1 h。在凝胶成像仪曝光检测蛋白表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体的鉴定

对所提取物质进行鉴定，透射电镜下观察到类圆形或杯状圆形的膜性小囊泡，边界清晰，呈外泌体典型茶托样结构（图1A）。纳米颗粒追踪分析结果显示，所提取物质的平均直径为125.9 nm，符合外泌体30～150 nm 的粒径范围（图1B）。蛋白质印迹法检测结果显示，所提取物质有外泌体标记蛋白CD9、CD63、CD81 的表达（图1C）。

图1 hucMSC-Exo 的鉴定Figure 1 Characterization of hucMSC-Exo

2.2 肾组织病理学变化及Paller 评分

肾组织病理学变化及Paller 评分结果见图2。与S 组比较，SS 组未见肾组织异常病理改变，两组间Paller 评分差异无统计学意义；IRI 组肾小管上皮细胞坏死脱落、颗粒样变性、炎症细胞浸润，肾小管刷状缘消失，可见胞浆空泡、管状管型形成，Paller 评分较S 组升高（P＜0.05）；与IRI 组比较，EXO 组肾组织病理损伤明显减轻，Paller 评分降低（P＜0.05）；与EXO 组比较，ES 组肾组织病理损伤加重，Paller评分升高（P＜0.05）。

图2 各组肾组织HE 染色及Paller 评分Figure 2 HE staining and Paller score of renal tissues in each group

2.3 血清肌酐和血尿素氮变化

各组血清肌酐和血尿素氮水平比较见图3。S 组与SS 组的血清肌酐和血尿素氮水平差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。与S 组比较，IRI 组血清肌酐和血尿素氮水平均升高，差异有统计学意义（均为P＜0.05）；与IRI 组比较，EXO 组血清肌酐和血尿素氮水平均下降，差异有统计学意义（均为P＜0.05）；与EXO 组比较，ES 组血清肌酐和血尿素氮水平均升高，差异有统计学意义（均为P＜0.05）。

图3 各组血清肌酐和血尿素氮水平Figure 3 Serum creatinine and blood urea nitrogen levels in each group

2.4 肾组织RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6 和PARP1 蛋白水平

各组肾组织RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6和PARP1 蛋白相对表达量比较见图4。与S 组比较，IRI 组RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白相对表达量均增加，TRPC6、PARP1 蛋白相对表达量均下降，差异有统计学意义（均为P＜0.05）；与IRI 组比较，EXO组RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白相对表达量均下降，TRPC6、PARP1 蛋白相对表达量均增加，差异有统计学意义（均为P＜0.05）；与EXO 组相比，ES 组RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白相对表达量均增加，TRPC6、PARP1 蛋白相对表达量均下降，差异有统计学意义（均为P＜0.05）。

图4 各组肾组织RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6、PARP1 蛋白表达水平Figure 4 The protein expression levels of RIPK1,RIPK3,MLKL,TRPC6 and PARP1 of renal tissues in each group

3 讨论

外泌体是细胞外囊泡的一种亚群，是直径在30～150 nm 范围内的一类纳米颗粒[13-15]。外泌体携带蛋白质、核酸、脂质等，参与细胞间的信号传递和通讯[16]。在外泌体中，特征蛋白包括CD9、CD63 和CD81，是外泌体膜上常见的四次跨膜蛋白，在膜融合、信号传递和蛋白质运输中发挥作用[17]。本实验的提取物在透射电镜下观察，为直径在30～150 nm 之间，呈典型茶托样结构，大小均一的膜性小囊泡。用纳米颗粒追踪分析检测粒径大小、浓度符合外泌体特征。而蛋白质印迹法检测结果显示有特征性膜蛋白CD9、CD63、CD81 的表达，证实提取物为外泌体。

越来越多的研究表明，间充质干细胞来源的外泌体（MSC-derived exosome，MSC-Exo）可能是一种新的无细胞疗法的载体，具有比间充质干细胞更显著的优势[18-19]。MSC-Exo 稳定且易于储存，不会被免疫系统排斥，是极具生物相容性的非免疫原性囊泡，且具有归巢效应、多重负载能力和易于表面修饰等内在特性，使其成为一种新的药物传递载体[20-21]。已有大量研究表明，MSC-Exo 在脑、心、肝、肾、肠、肺IRI中发挥保护作用，为治疗IRI提供了新的策略[22]。本研究通过大鼠肾实质注射外泌体后，肾组织病理损伤明显减轻，Paller 评分、血清肌酐和血尿素氮水平显著降低，提示外泌体减轻了大鼠肾IRI。在肾IRI 中，坏死性凋亡是导致组织损伤的机制之一[23-24]。坏死性凋亡是Degterev 等[25]在2005年首次提出的一种新型程序性细胞死亡方式，细胞坏死性凋亡的启动和执行依赖于RIPK1、RIPK3 以及MLKL 的活化[26]。研究表明，坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1 可通过靶向抑制RIPK1，改善肾IRI 诱导的炎症免疫反应[27]。此外，Liu 等[28]研究发现在肾IRI 后，坏死性凋亡核心分子RIPK1、RIPK3 和MLKL 的表达上调，抑制坏死性凋亡可减轻肾IRI 介导的急性肺损伤。本研究发现，肾IRI 后RIPK1、RIPK3、MLKL 表达水平增加，给予hucMSC-Exo 治疗后上述指标显著降低，与Yuan 等[29]的研究一致，进一步证实外泌体通过抑制坏死性凋亡在肾IRI 中发挥保护作用。

TRPC6 是一种非选择性Ca2+渗透性阳离子通道，广泛表达于肾组织，是维持正常肾功能的重要蛋白[30-31]。已有研究表明TRPC6 参与器官IRI 的过程，是IRI 发病机制中上调的差异表达基因，提示其可能是治疗IRI 的潜在分子靶点[32-34]。研究发现，肾IRI 在体内和在体外均可导致TRPC6 表达下调，TRPC6 可通过促进肾小管上皮细胞锌离子内流和自噬，抑制坏死和炎症反应，最终减轻肾IRI[35-36]。肾IRI 后，坏死性凋亡相关通路被激活，TRPC6 可通过调节细胞内游离Ca2+，减轻钙超载，抑制肾小管上皮细胞坏死性凋亡来减轻肾IRI，改善肾功能[7]。此外，Shen 等[11]研究发现PARP1 的活性是钙依赖的，TRPC6 可通过下游PARP1 作用抑制肾小管上皮细胞坏死性凋亡保护肾IRI。本实验研究证实，尾静脉注射TRPC6 抑制剂SKF96365 后，大鼠肾组织形态、Paller 评分及血清肌酐、血尿素氮水平未见异常改变，表明此剂量的SKF96365 在安全剂量范围内，未对大鼠肾组织产生损害。进一步研究发现，外泌体治疗后TRPC6、PARP1 表达增加，提示TRPC6 参与了外泌体对肾IRI 的保护作用。进一步给予TRPC6 抑制剂SKF96365 后，TRPC6、PARP1 表达降低，肾组织病理损伤加重，Paller 评分、血清肌酐和血尿素氮水平增加，RIPK1、RIPK3、MLKL 表达水平增加，逆转了外泌体的保护作用，提示外泌体可通过调节TRPC6/PARP1 通路减轻肾IRI 诱导的坏死性凋亡，发挥对肾IRI 保护作用。

综上所述，本研究结果表明hucMSC-Exo 可减轻大鼠肾IRI 所致的坏死性凋亡，其保护机制与TRPC6/PARP1 通路激活有关，为肾IRI 提供了一种新的潜在治疗方法。