番木瓜叶多酚提取工艺的优化及抗氧化活性研究

赵 珂，程守前，刘小双，王连倩，陈湛娟，于飞飞，高亚男*

（1. 海南医学院 药学院，海南 海口 571199；2. 齐鲁制药（海南）有限公司，海南 海口 570314）

番木瓜（Carica papayaL.）是番木瓜科番木瓜属植物，又名万寿果。目前我国主要种植在广东、海南、广西、云南、福建等热带、亚热带地区。番木瓜属药食同源类食品，目前关于番木瓜的研究主要集中在其果实及种子。研究表明，其果实中含丰富的木瓜蛋白酶、类胡萝卜素、黄酮类、萜烯类、多酚类和生物碱等多种营养成分和植物化学物质，种子中含大量的异硫氰酸酯类和硫代葡萄糖苷类物质，具有抗肿瘤、增强免疫调节及抗炎、抑菌等作用[1-7]。而番木瓜叶作为番木瓜的可再生附加物鲜有研究，目前仅有番木瓜叶中含番木瓜碱类、黄酮类、酚类等的报道，关于其进一步的药理活性研究甚少。番木瓜叶在印度及澳大利亚有广泛的民间药用报道，主要用于治疗发烧、哮喘、脚气病、腹绞痛及预防和治疗癌症[8-9]。

多酚类物质是一族在分子结构中含若干个酚羟基的化合物，属于植物的次生代谢产物，广泛存在于植物体内。国内外研究发现，植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗癌及辅助治疗心血管疾病等多种生物功能[10-11]。本文采用超声辅助提取番木瓜叶中的多酚，根据单因素试验结果，选取影响提取番木瓜叶多酚含量较大的因素，采用响应面法优化其提取工艺，最大程度地对多酚类物质进行提取，并对提取物中多酚类物质的体外抗氧化活性进行研究，为番木瓜叶的综合开发利用提供依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

SK3210HP 型超声仪（上海科导）；R201D旋转蒸发仪（巩义予华）；SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义予华）；LYSF-200-B2型超高速多功能粉碎机（长沙卓成）；TD4C离心机（长沙英泰）；TP-520A电子天平（湘仪天平）。

1.2 材料

番木瓜叶，采摘于海南省海口市龙华区，清洗干净后于40 ℃烘箱烘干，用粉碎机粉碎，过40目筛，备用；无水乙醇（西陇科学）；维生素C（天津市大茂化学试剂厂）；没食子酸（源叶生物）；三氯化铁（广州化学试剂厂）；福林酚（源叶生物）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，源叶生物）；铁氰化钾（广州化学试剂厂）；三氯乙酸（罗恩）；碳酸钠（西陇科学）。

2 方法

2.1 没食子酸标准曲线的确定

采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量[12]。精密称取没食子酸对照品10.00 mg，置入100 ml量瓶，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.1 mg/ml没食子酸对照品溶液。分别精密量取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml没食子酸对照品溶液，置于7支10 ml比色管中，分别编号0～6，每管均加入1 ml福林酚显色剂，振摇后放置2 min，再加入10 %碳酸钠溶液5 ml，纯水稀释至刻度，摇匀后室温避光放置1 h，以0号管为空白，在波长760 nm处测定0～6管的吸光度，以没食子酸质量浓度为横坐标，760 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.2 番木瓜叶多酚的提取和测定

称取番木瓜叶粉末2.0 g，置于带盖的锥形瓶中，按液料比加入提取溶剂，在一定温度、功率下，超声提取一定时间，冷却过滤，并进行减压浓缩，再用纯水稀释至100 ml，摇匀，备用。精密吸取上述样品溶液0.3 ml，按2.1项下方法配制样品溶液，并测定其吸光度值，然后根据标准曲线方程计算多酚含量。

2.3 番木瓜叶多酚提取工艺条件的确定

2.3.1 单因素试验[13]

2.3.1.1 乙醇浓度 称取6份番木瓜叶粉末，每份2.0 g，按液料比20:1分别加入40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %乙醇，在超声功率100 W，温度50 ℃条件下提取60 min，按2.2项下方法处理样品并根据标准曲线方程计算多酚含量。

2.3.1.2 液料比 称取6份番木瓜叶粉末，每份 2.0 g，按液料比5:1，10:1，15:1，20:1，25:1，30:1 ml/g分别加入70 %乙醇，在超声功率100 W，温度50 ℃条件下提取60 min，按2.2项下方法处理样品并根据标准曲线方程计算多酚含量。

2.3.1.3 提取温度 称取5份番木瓜叶粉末，每份2.0 g，按液料比20:1加入70 % 乙醇，分别在超声温度为20，30，40，50，60 ℃，超声功率100 W条件下提取60 min，按2.2项下方法处理样品并根据标准曲线方程计算多酚含量。

2.3.1.4 提取时间 称取7份番木瓜叶粉末，每份2.0 g，按液料比20:1加入70 %乙醇，在超声功率100 W，超声温度50 ℃条件下，分别提取 20，40，60，80，100，120，150 min，按2.2项下方法处理样品并根据标准曲线方程计算多酚含量。

2.3.1.5 超声功率 称取5份番木瓜叶粉末，每份2.0 g，按液料比20:1加入70 %乙醇，分别在超声功率 60，80，100，120，150 W，超声温度50 ℃条件下提取60 min，按2.2项下方法处理样品并根据标准曲线方程计算多酚含量。

2.3.2 响应面法优化设计 根据单因素试验的结果，选用乙醇浓度、液料比、提取时间、超声功率作为Box-Behnken自变量，以番木瓜叶多酚含量为响应值进行四因素三水平响应面优化试验，响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素水平编码

2.4 抗氧化活性的测定

2.4.1 DPPH·清除能力的测定 参照文献[14]方法测定。

2.4.2 还原力的测定 参照文献[15]的方法测定。

2.5 数据统计与分析

采用Dexign-Expert 8.0.6.1设计响应面优化试验，采用Excel进行数据分析。

3 结果与分析

3.1 多酚标准曲线的建立

以没食子酸质量浓度为横坐标，760 nm处的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为：y=0.1327x-0.1151，相关系数r=0.9985。

3.2 各单因素试验结果

3.2.1 乙醇浓度对番木瓜叶提取物多酚含量的影响结果见图1。

由图1可见，当乙醇浓度在40 %～50 %浓度范围时，随乙醇浓度上升，多酚含量增加；在乙醇浓度在50 %～90 %范围内时，随乙醇浓度下降，多酚含量呈下降趋势，这可能是由于乙醇浓度过高会使蛋白质等大分子变性沉淀，阻碍多酚从组织细胞内向提取溶剂扩散[16]。因此，选择合适的乙醇浓度为50 %。

3.2.2 液料比对番木瓜叶提取物多酚含量的影响 结果见图2。

图2 液料比对番木瓜叶提取物多酚含量的影响

由图2可见，多酚含量随液料比的增加而迅速增大，这是由于提取溶剂的增加增大了番木瓜叶和提取溶剂的接触面积，有利于多酚的溶出。液料比为15:1 ml/g时，多酚含量达最大，之后随液料比的增加而逐渐降低，这可能是由于液料比的增加致更多的杂质溶出，从而降低提取效果[17]。因此，选择液料比15:1 ml/g。

3.2.3 提取温度对番木瓜叶提取物多酚含量的影响结果见图3。

图3 提取温度对番木瓜叶提取物多酚含量的影响

由图3可见，随着提取温度的升高，多酚含量先增加后下降，当温度为50 ℃时，多酚含量最高。温度升高可提高番木瓜叶多酚的含量，但温度过高可能导致多酚物质被分解，从而降低多酚含量。因此，选择提取温度为50 ℃。

3.2.4 提取时间对番木瓜叶提取物多酚含量的影响结果见图4。

图4 提取时间对番木瓜叶提取物多酚含量的影响

由图4可见，随着提取时间的延长，多酚含量逐渐增加，且在超声100 min时趋于平衡，这可能是由于超声时间达100 min时，多酚基本已溶出，超声时间过长，有可能增加杂质的溶出，且提取的成本也会增加，因此选取超声时间为120 min。

3.2.5 超声功率对番木瓜叶多酚含量提取的影响 结果见图5。

图5 超声功率对番木瓜叶提取物多酚含量的影响

由图5可见，超声功率为60～120 W时，多酚含量随超声功率的增大而升高，超声功率大于120 W时，多酚含量反而呈下降趋势，推测功率过高会使此成分分解。因此，选择最适宜的超声功率为120 W。

3.3 响应面试验结果

根据单因素试验结果，选取乙醇浓度、液料比、提取时间及超声功率对多酚含量影响显著的因素进行4因素3水平响应面试验，结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

对表 2 数据进行二次多项式回归模型方程拟合， 得回归方程： 多酚含量=11.60-2.11A+0.25B+0.12C+0.19D+0.67AB-0.45AC+0.14AD+0.095BC+0.35BD-0.19CD-1.42A2-1.26B2-1.52C2-0.89D2, 方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.0001，表明响应面回归模型极其显著，失拟项（P=0.3914＞0.05）不显著，试验误差小，表明未知因素对结果影响较小。R2=0.9486，R2adj=0.8972，表明模型拟合程度良好。根据P值可知，一次项A和二次项A2、B2、C2对多酚含量影响极其显著，AB的P值小于0.05，表明其对提取物的多酚含量影响显著。由F值的大小可判断各因素对多酚含量的影响大小依次为乙醇浓度＞液料比＞超声功率＞提取时间。响应面分析见图6。

表3 方差分析表

图6 各因素交互作用对番木瓜叶提取物多酚含量的影响

3.4 最佳提取工艺确定及验证试验

由以上结果确定最优提取工艺为：乙醇浓度52.97 %，液料比16.23 ml/g，提取时间123.65 min，超声功率84.36 W，番木瓜叶提取物中多酚含量为12.33 mg/g，考虑到生产操作的实际情况及节约成本，将其修正为乙醇浓度53 %，液料比16 ml/g，提取时间124 min，超声功率90 W。按上述优化工艺进行验证试验，测得多酚含量为12.29 mg/g，与预测值12.33 mg/g接近，表明模型预测性良好。

3.5 抗氧化性活性分析

3.5.1 番木瓜叶多酚对DPPH自由基的清除作用结果见图7。

图7 番木瓜叶多酚对DPPH自由基的清除能力

由图7可见，番木瓜叶多酚浓度为0.2～1.0 mg/ml时，随着多酚浓度的不断增加，对DPPH自由基的清除率呈上升趋势。番木瓜叶多酚浓度为1.0 mg/ml时，清除率达90.92 %，接近同浓度的维生素C（92.01 %）。

3.5.2 番木瓜叶多酚的铁离子还原能力 结果见图8。

图8 番木瓜叶多酚的铁离子还原能力

由图8可见，番木瓜叶多酚在0.2～1.0 mg/ml浓度范围内时，随着多酚浓度的不断增加，其铁离子还原能力呈上升趋势。番木瓜叶多酚浓度为1.0 mg/ml时，其铁离子还原能力与同浓度维生素C溶液的铁离子还原能力相接近。

4 结论

本研究以单因素试验为基础，采用响应面法优化超声辅助提取番木瓜叶多酚的工艺。试验结果表明，乙醇浓度及乙醇浓度和液料比的交互作用对番木瓜叶提取物多酚含量有显著影响，各因素对番木瓜叶提取物多酚含量影响的主次顺序如下：乙醇浓度＞液料比＞超声功率＞提取时间。番木瓜叶多酚最佳提取工艺参数如下：乙醇浓度53 %，液料比16 ml/g，提取时间124 min，超声功率90 W，在此条件下，测得番木瓜叶提取物多酚含量为12.29 mg/g。此外，体外抗氧化活性实验结果表明，番木瓜叶多酚对DPPH自由基具有较强的清除能力，清除率可高达90.92 %（多酚浓度为1.0 mg/ml）；对铁离子也具有较好的还原能力。本研究将为番木瓜叶的进一步研究提供重要的参考依据。