基于网络药理学和实验验证探究金银花-黄连治疗咽炎的作用机制

刘曼婷，杨玉畅，胡盼祥，董晓旭，尹兴斌，曲昌海，倪 健

（北京中医药大学 中药学院，北京 102488）

金银花（Lonicerae Japonicae Flos）味甘，性寒，具有清热解毒，疏散风热的功效，临床用于治疗喉痹，风热感冒。黄连（Coptidis Rhizoma）味苦，性寒，具有清热燥湿，泻火解毒的功效，临床用于治疗痈肿疔疮，牙痛口疮[1]。二者均为清热药，临床常配伍使用。数据挖掘156首含黄连的处方中，配伍金银花使用25首，如清营汤、银花解毒汤、栀子金花丸等[2]。金银花-黄连配伍的经典方剂最早来源于《外科发挥》的清咽利膈汤，主治急性咽喉痛，肺胃实热，咽喉红肿疼痛，痰涎壅盛。通过《中医方剂大辞典》数据挖掘，已知金银花、黄连均是喉痹内服方剂中使用频数＞20的中药[3]。现代药理学研究发现，二者可抑制痢疾杆菌，提高机体体液免疫和细胞免疫及网状内皮系统的吞噬功能，可合用治疗喉咙肿痛[4-6]。咽炎（pharyngitis）是咽部黏膜、黏膜下组织及其淋巴组织由病毒、细菌、真菌（如肺炎支原体、A组链球菌）等感染引起的非特异性炎症，常为肺炎等疾病的前驱症状[7-8]。网络药理学是依托系统生物学，从三维整体观探究中药多成分、多靶点、多通路协作机制，构建分析“成分-基因-疾病”的多维度生物机制网络，从而降低药物的研发成本，指导临床精准用药[9-11]。本研究采用网络药理学方法构建金银花-黄连的可视化网络，解析金银花-黄连治疗咽炎的活性成分、作用靶标、生物学机制，并进行初步动物实验验证，以期阐明其治疗咽炎的效应机制。

1 材料与方法

1.1 数据库

数据库信息见表1。

表1 数据库信息

1.2 化学成分的筛选与核对

登录TCMSP搜索金银花、黄连的有效成分，设置DL≥0.18，OB≥30 %，对有效成分进行筛选，将所得成分的结构输入Pubchem核对结构、名称、分子式，最终获得关键化合物。

1.3 潜在靶点的预测与筛选

将关键化合物的信息输入Pharm Mapper数据库，获得候选基因的靶点信息，并通过Uniprot数据库进行标准化处理，再与通过Genecards数据库筛选出咽炎的靶点基因进行映射，得到药物-疾病候选基因的VENN图。

1.4 构建多水平网络系统

1.4.1 PPI网络构建 将金银花-黄连与咽炎的潜在靶点基因导入STRING数据库，设置物种为人类（Homosapiens），获得蛋白互作关系网络，设置蛋白关系评分为0.4，隐藏游离蛋白，筛选排名前15的核心基因。

1.4.2 “药物-化合物-靶点-疾病”网络构建 使用Cytoscape 3.7.1软件对所得信息进行三维网络处理，使“药物-化合物-靶点-疾病”的关系以网络图的形式呈现。在这个网络图中，将关键化合物和靶点设置为节点，边代表节点之间相互作用的关系。

1.5 靶点通路富集分析

将潜在靶点基因输入DAVID数据库，并指定物种为“Homosapiens”，界定阈值P＜0.05，将分析结果绘制成气泡图，图中基因数用气泡大小表示，P值高低用气泡颜色表示。

1.6 分子对接前处理

在RCSB 蛋白数据库中输入蛋白互作网络图中度值前三的靶蛋白名称，选取最高分辨率的靶蛋白结构，使用Pymol软件预处理：（1）去除水分子；（2）去除原配体分子；（3）运行AutoDockTolls 4.2.6为受体分子加极性氢；利用 Chem3D将关键成分文件转化为mol2格式。

1.7 分子对接

将前处理后的配体和关键靶点导入AutoDock 4.2.6进行格点能计算，进行分子对接。以最低结合能作为靶蛋白和配体对接的结果，使用Pymol软件进行可视化处理。

1.8 动物实验验证

1.8.1 实验动物 SD大鼠36只，雄性，SPF级，体重200±20 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2022-0010。

1.8.2 主要药品与试剂 黄连饮片（批号：501002642，北京同仁堂药材有限责任公司）；金银花（批号：20180427，北京本草方源药业集团有限公司）；大鼠基质金属蛋白酶2 ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；大鼠白介素2（IL-2）ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；阿司匹林（上海上药信谊药厂有限公司）。

1.8.3 药物制备 参考文献[12]，以水提醇沉的方法制备黄连-金银花浸膏粉，黄连与金银花的质量比为1:2，加水煎煮3次，每次加8倍量水煎煮1 h，合并药液，加入乙醇使含醇量达50 %，置于4 ℃冰箱过夜，过滤杂质，减压旋蒸、真空干燥得到干浸膏粉，每克含生药材3.1 g，置阴凉干燥处密封保存。

1.8.4 造模与给药 取36只正常SD大鼠随机分为6组，分别为空白对照组，模型组，高、中、低剂量金银花-黄连组，阿司匹林阳性对照组，每组6只。正常组大鼠咽部喷生理盐水，其余组大鼠造急性咽炎模型，用喉头喷雾器向其咽部喷雾25 %氨水，2次/d，上午、下午各1次，每次喷3下，连续喷3 d，大鼠造模成功的标志为咽部黏膜出血、红肿[13]。于第4天起，对大鼠进行灌胃给药，每天1次，连续给药7 d，高、中、低剂量给药组分别给予金银花-黄连浸膏粉2.8，1.4，0.7 g/(kg·d)，阳性对照组给予阿司匹林200 mg/kg，空白对照组和模型组给予生理盐水10 ml/kg。

1.8.5 观测指标 实验过程中每天观察并记录各组动物饮食情况、活动情况、咽部黏膜状态（包括颜色、分泌物等）。大鼠灌胃1周后腹主动脉取血，血液室温自然凝固10～20 min后，3000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清，按试剂盒说明书操作，采用ELISA法测定各组大鼠血清中基质金属蛋白酶2（MMP-2）、IL2的含量。

1.8.6 统计学方法 实验数据统一采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间数据采用单因素方差分析；各组间的两两比较，方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane’s检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金银花-黄连关键化合物的筛选

本研究初步筛选出关键化合物37个，其中包括黄连的关键化合物14个，金银花的关键化合物23个。经与Pubchem核对后共得33个关键化合物，表2为关键化合物信息采集表。

表2 金银花-黄连中的关键化合物

2.2 潜在治疗靶点基因的预测

在TCMSP平台下载关键化合物的信息以“mol2”的格式导入Pharm Mapper数据库，获得802个靶标信息，经删除重复项剩余183个，并以此构建关键化合物靶标信息数据库，通过Uniprot进行基因ID的标准化核对，并使用R语言校准。通过Genecards数据库检索咽炎的靶点基因，输入“pharyngitis”，获取基因共1803个，将金银花-黄连与咽炎的靶点基因进行映射，得到金银花-黄连-咽炎的潜在治疗靶点基因共46个（见表3），并通过R语言绘制成VENN图（见图1）。

表3 金银花-黄连治疗咽炎的潜在靶点基因

图1 金银花-黄连靶标与咽炎靶标的韦恩图

2.3 PPI网络构建

PPI网络图见图2。该网络包含207条边，46个节点，靶蛋白平均度值为9，有22个靶蛋白的度值超过9（见图3），说明这22个靶蛋白是PPI网络中的重要靶点。

图2 金银花-黄连潜在治疗靶点的相互作用网络

图3 金银花-黄连治疗咽炎的重要靶点

2.4 绘制作用机制可视化网络

将筛选获得的药物活性成分、潜在治疗靶点基因、药物、疾病名称导入Cytoscape 3.7.1软件，设置节点与边线，将其相互关系绘制成可视化“药物-化合物-靶点-疾病”网络图（见图4）。网络共涉及节点（Nodes）77个，边线（Edges）378条，其中长方形节点代表潜在治疗靶点基因，菱形节点代表药物活性成分，圆形节点代表药物，三角形节点代表疾病，边线表示化合物、靶点、药物、疾病之间存在相关性。通过插件cytoNCA按度（degree）、紧密度（closeness）两种属性分别取平均值排序，筛选两者均大于平均值（分别为9.82和106.03）且靠前的成分或者靶点。成分有obacunone（黄柏酮）、palmidin A（掌叶二蒽酮A）、caeruloside C、quercetin（槲皮素），靶点有HRAS。

图4 中药-成分-靶点-疾病网络图

2.5 Go与KEGG通路分析

共获得GO条目48个（P＜0.05），涉及生物过程（BP）条目34个，细胞组成（CC）条目6个，分子功能（MF）条目8个，分别占72 %，11 %，17 %，根据P值由小到大筛选排名前20的通路绘制气泡图（见图5～7），未满足20条通路的功能选取其所有通路。含靶点数量越多的通路对咽炎的治疗潜力越大，生物过程分析中（见图5）靶点富集数目较多的有蛋白水解（proteolysis）、细胞增殖调控（regulation of cell proliferation）、凋亡过程负调控（negative regulation of apoptotic process）；分子功能分析（见图6）中靶点富集数目较多的有锌离子结合（zinc ion binding）、ATP结合（ATP binding）、受体结合（receptor binding）；细胞组分分析（见图7）中靶点富集数目较多的有细胞外基质（extra cellular matrix）、内吞小泡（endocyticvesicle）、膜筏（membraneraft）。

图5 金银花-黄连潜在靶标的生物功能富集分析

图6 金银花-黄连潜在靶标的分子功能富集分析

图7 金银花-黄连潜在靶标的细胞组分富集分析

KEGG通路富集筛选得到48条信号通路（P＜0.05），根据P值由小到大筛选排名前20的通路绘制气泡图（见图8），经分析得雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、促性腺激素释放激素信号通路（GnRH signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway），这4条信号通路是治疗咽炎的主要通路。

图8 金银花-黄连潜在靶标的KEGG通路富集分析

2.6 分子对接结果

结果见表 4，表示活性化合物和靶蛋白具有结合能力。结果表明，靶蛋白与活性成分之间结合活性度越高，最低结合能的绝对值就会越低，说明两者之间结合能力越好。图9表示靶蛋白与活性化合物对接最好的组合，结果显示，黄柏酮、掌叶二蒽酮A等与抗咽炎药物潜在作用靶点具有自发的亲和力。

图9 Obacunone与MMP-2、Palmidin A与MAPK1、Obacunone与EGFR的结合模式

表4 关键靶点与关键化合物的对接结果

2.7 动物实验验证结果

2.7.1 各组大鼠一般情况与症状表现 造模3 d后，正常组大鼠正常饮食，活动正常，咽部黏膜形态正常，未见分泌物；模型组大鼠食欲下降，精神欠佳，咽部黏膜出现充血、肿胀，黏液分泌增多，同时伴有搔抓口部的现象。灌胃1周后，金银花-黄连各剂量给药组、阿司匹林组大鼠咽部黏膜的红肿状态均有不同程度减轻。

2.7.2 各组大鼠血清中MMP-2和IL-2水平 上述网络药理学结果表明黄连-金银花可能作用于MMP-2、IL-2等靶点发挥抗咽炎的作用，本研究进一步验证了金银花-黄连对急性咽炎大鼠血清中MMP-2、IL-2水平的影响，见表5。由表5可见，模型组大鼠血清中的MMP-2和IL-2水平较正常组升高（P＜0.05），另外阿司匹林组及JYH-HL各剂量给药组大鼠血清中的MMP-2和IL-2含量较模型组降低（P＜0.05），提示金银花-黄连能降低急性咽炎大鼠血清中IL-2和MMP-2的表达。

表5 各组大鼠血清中MMP-2和IL-2含量（ ±s，n=6）

表5 各组大鼠血清中MMP-2和IL-2含量（ ±s，n=6）

注：与空白对照组比较：#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05

组别 MMP-2/pg·ml-1 IL-2/pg·ml-1空白对照组 536.32±41.34 24.71±3.45模型组 720.78±39.67# 36.88±3.97#金银花-黄连高剂量组 613.63±53.78* 28.69±2.56*金银花-黄连中剂量组 654.78±58.43* 31.02±2.88*金银花-黄连低剂量组 686.98±40.12* 32.74±1.37*阿司匹林组 624.12±47.86* 27.04±2.41*

3 讨论与结论

本研究通过可视化网络分析筛选出金银花-黄连治疗咽炎的4个潜在活性成分，分别为黄柏酮（obacunone）、掌叶二蒽酮A（palmidin A）、caeruloside C、槲皮素（quercetin）。通过PPI筛选发现MAPK1、EGFR、MMP-2、IL-2、HRAS、CASP3、ALB等是金银花-黄连治疗咽炎的关键靶点。

综上，金银花-黄连治疗咽炎的作用机制可能是其有效成分黄柏酮、掌叶二蒽酮A、Caeruloside C、槲皮素通过MAPK1、EGFR、MMP-2、IL2、HRAS、CASP3、ALB等关键蛋白介导雌激素信号通路、GnRH信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等协作产生抗炎、免疫杀伤、黏膜修复、运化外毒素等直接作用以及黏附缓释等间接作用来防治咽炎。