基于T1WI 增强的MR 纹理分析评价胶质母细胞瘤MGMT 启动子甲基化的研究

王汝佳 马梦华 王海平 孙静华 杨越清 闫赛克

胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤，2021年世界卫生组织重新对胶质瘤进行了分类，该标准重点强调了分子诊断学在中枢神经系统（central nervous system，CNS）肿瘤分类中的作用［1］。其中，胶质母细胞瘤（glioblatoma，GBM）是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的46%，预后较差，5 年生存率不超过5%［2,3］。针对不同分子表型GBM 进行个体化治疗，对于GBM患者来说是十分重要的，但是由于病理活检的有创性以及O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）启动子甲基化状态的检测费用昂贵，因此针对GBM 患者的个体化治疗很难有效实施。本研究主要是通过3D Slicer 软件进行GBM 异质性的磁共振纹理特征分析，期望可以为判别GBM 的分子表型提供帮助，进一步为患者提供个体化的治疗，改善预后，提高患者的生活质量。

资料与方法

1.一般资料

收集本院从2015 年6 月～2018 年9 月年均经病理诊断为GBM 的患者共128 例，其中男58 例，女70 例，平均年龄（61±12.6）岁。一般临床资料包括患者的年龄、性别、术前卡氏评分（Karnofsky performance status，KPS）、治疗方法。所有患者术前均进行常规及增强磁共振检查。影像资料包括：肿瘤的位置、生长方式、肿瘤边缘、强化程度、占位效应、水肿程度、是否跨越中线、是否累及室管膜下。纳入标准：临床、病理及影像资料完整、可靠；术前未经过放疗及化疗等其他辅助治疗；术后经病理确诊为GBM。排除标准：患者合并其他恶性肿瘤病史。所有病例标本均进行了MGMT 启动子甲基化的检测。其中，MGMT 启动子甲基化GBM 有79例，MGMT 启动子未甲基化GBM 有49 例。

2.MGMT 启动子甲基化状态检测

手术切除的脑组织标本，均经3.7%中性缓冲甲醛液固定、石蜡包埋后切成4 μm 厚的组织切片。获取患者存档的石蜡包埋组织提取DNA，通过亚硫酸氢盐对DNA 进行前期处理，采用巢式甲基化特异性聚合酶链反应（nested methylation-specific polymerase chain reaction，nMSP）法检测MGMT 启动子甲基化状态，运用特异性引物扩增目的区段。判断标准：采用仅MGMT-U 引物扩增出相应片段，判断为未甲基化；仅MGMT-M 引物扩增出相应片段或MGMT-U 引物和MGMT-M 引物均扩增出相应片段，判断为甲基采用仅MGMT-U 引物扩增出相应片段，判断为未甲基化；仅MGMT-M 引物扩增出相应片段或MGMT-U 引物和MGMT-M引物均扩增出相应片段，判断为甲基化［4］。

3.检查方法

采用Philips 3.0 T 磁共振扫描仪，8 通道SENSE头部线圈，每位患者术前均进行了常规及增强磁共振检查，包括：横断位T1WI、横断位和矢状位T2WI、横断位T2液体衰减反转恢复（T2-weighted fluid attenuated inversion recovery，T2-FLAIR）和T1WI增强（contrast-enhanced T1-weighted imaging，T1WI+C）检查。扫描参数：横断位T1WI：TR 2270 ms，TE 20 ms，视野196 mm×196 mm，矩阵288×190，激励次数2，层厚6 mm，层间距1 mm。横断位和矢状 位T2WI：TR 2500 ms，TE 90 ms，视 野230 mm×230 mm，矩阵420×306，激励次数2，层厚6 mm，层间距1 mm。横断位T2-FLAIR：TR 8000 ms，TE 120 ms，视野230 mm×230 mm，矩阵304×216，激励次数2，层厚6 mm，层间距1 mm。增强扫描经静脉注入钆喷葡胺（gadopentetate dimeglumine，Gd-DTPA），剂量为0.1 ml/kg 体重，注射流率为3 ml/s。T1WI 增强：TR 200 ms，TE 2 ms，视野230 mm×230 mm，矩阵256×256，激励次数2，层厚6 mm，层间距1 mm。

4.图像处理

从PACS 工作站以DICOM 格式导出所有患者的MRI 图像，将其导入到3D Slicer 开源软件中（3D Slicer，version 4.4.0，http://slicer.org/）。首先，由3名经验丰富的神经影像学医生通过3D Slicer 软件中的Editor 模块从横断位T1WI 增强图像中提取磁共振纹理特征，沿肿瘤边缘手动勾画每一层兴趣区（regions of interest，ROI），尽可能地保证准确勾画出肿瘤的边界，3 名医生达成一致意见，重组出肿块的三维立体模型（图1）。然后，3 名医生利用Hetergeneity CAD 扩展模块来提取肿瘤的磁共振纹理特征，只有当3 名医生勾画的ROI 组内相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC）大 于0.75时才进行后续工作与分析。最后，计算出以下四方面内容：一阶统计量、形态和形状、纹理：灰度共生矩阵、纹理：灰度运行长度矩阵。

图1 3D Slicer GBM 磁共振肿瘤重组示意图

5.数据分析方法

使用SPSS 22.0 版本进行数据分析，MGMT 启动子甲基化GBM 与磁共振特征的关系，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义；通过3D Slicer获得的属于正态分布、方差齐的变量，采用独立样本t 检验；不符合正态分布、方差不齐的变量，采用Mann-Whitney U 检验，分析MGMT 启动子甲基化状态和GBM 磁共振纹理特征的联系，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1.MGMT 启动子甲基化状态与GBM 磁共振特征的关系

MGMT 启动子甲基化GBM 79 例，MGMT 启动子未甲基化GBM 49 例，两者磁共振特征相比较，无显著差异（P＞0.05）（表1，图2、3）。

表1 MGMT 启动子甲基化状态与GBM 磁共振特征的关系

2.MGMT 启动子甲基化状态与GBM 磁共振纹理特征的关系

通过3D Slicer 提取的31 种纹理特征中，MGMT启动子甲基化GBM 与MGMT 启动子未甲基化GBM 的磁共振纹理特征相比较，有7 种磁共振纹理特征差异有统计学意义（P＜0.05），分别是能量（Energy）、熵（Entropy）、一致性（Uniformity）、自相关（Autocorrelation）、方差：灰度共生矩阵（Variance:Gray Level Co-occurrence Matrix，GLCM）、灰度不均匀性（Gray Level Non-uniformity，GLN）、群集阴影（Cluster Shade）（表2、3）。

表2 MGMT 启动子甲基化状态与GBM 异质性的磁共振纹理分析（均值±标准差，独立样本t 检验）

讨 论

由于GBM 恶性程度极高，侵袭性更高，使得放疗、化疗以及联合治疗等方法都难以取得令人满意的效果。2021 版分类标准将组织学分类和分子表型整合在一起［1］，整合的分子表型包括：IDH-1、MGMT、1p/19q、BRAF、ATRX 等，其中尤以MGMT与GBM 的联系较为密切［5-9］。MGMT 是DNA 修复蛋白，可逆转由烷化剂引起的DNA 损伤，其修复DNA的机制是通过移除O6-烷基-鸟嘌呤（O6-alkylguanine，O6-AG）上的烷基，当MGMT 启动子区域的超甲基化时，使得MGMT 表达沉默，导致MGMT介导的DNA 修复酶的缺乏，基于此，通过使用替莫唑胺类烷化剂能够提高GBM 的生存率［10］。

针对不同分子表型的GBM 进行个体化治疗，对于GBM 患者来说是很重要的，但由于病理活检的有创性以及MGMT 启动子甲基化状态的检测费用昂贵，因此针对GBM 患者的个体化治疗很难有效实施。不同基因表型GBM 的异质性大相径庭，GBM 在遗传学和组织病理水平上都存在异质性，比如细胞结构中GBM 内部空间的多样性、血管新生、血管外的基质、坏死面积等［11］。GBM 内部不均质性是肿瘤恶性程度的公认指标，其反映了富细胞密度区域，坏死、出血和黏液样变，瘤内不均质性也是影响预后的重要因素，并且和肿瘤的级别相关［12］。但是，GBM 的异质性通过人类肉眼是无法辨别的，而磁共振纹理特征分析是一种影像过程中的算法，以分析图像中像素或者体素分布和联系为基础，打破了只能通过人类视觉系统定性地评估肿瘤异质性的局限性［13］。

表3 MGMT 启动子甲基化状态与GBM 异质性的磁共振纹理分析（均值，U 检验）

目前，Kickingereder 等［14］研究发现，磁共振纹理特征和分子特性之间存在相关性。但是软件分析的可靠性和准确性有待提高，关于GBM 异质性的磁共振纹理分析研究较少，且应用的软件也没有一定标准，可用的软件包括OsiriX、MaZda、3D Slicer 等。其中，OsiriX 是苹果系统专用软件，属于非公开软件，对导入的数据信息类型及设备型号有专门要求。MaZda 软件虽然是开源软件，但是它只能在一个二维层面上提取肿瘤信息，在保存为BMP 格式的图片上一层一层地勾画出肿瘤的信息，不可避免导致肿瘤信息的丢失。3D Slicer 是一个用于分析和了解医学图像数据的免费开源软件。近20 年来，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）多次拨款创建了Slicer，提供了强大的医学图像处理功能。3D Slicer 属于可视化和数据分析工具，可扩展，具有强大的插件功能，用于添加算法和应用程序。3D Slicer 能够在三维空间上重组出肿瘤体积，包含了肿瘤的全部信息，尽可能避免了肿瘤信息的丢失。Bouget 等［15］均认为使用3D Slicer 半定量分割软件工具，能够提高对GBM 分割的可靠性，克服了主观因素的影响，量化了纹理参数，得出数值更为直观、准确。本研究利用3D Slicer 中的Hetergeneity CAD 扩展模块提取了31 种肿瘤异质性的纹理特征，MGMT 启动子甲基化GBM 与MGMT 启动子未甲基化GBM的磁共振纹理特征相比较，有7 种磁共振纹理特征存在差异（P＜0.05），分别是能量、熵、一致性、自相关、方差：灰度共生矩阵、灰度不均匀性、群集阴影。临床上经常用的纹理特征主要有能量、熵、自相关。其中，能量主要和肿瘤细胞的异质性差异有关，主要反映了肿瘤细胞排列方式。熵是目前临床上被应用广泛的纹理特征，在多种恶性肿瘤的诊疗中发挥着重要作用。基于T1WI 增强的纹理分析，期望可以为判别GBM 患者中MGMT 启动子甲基化状态提供一定的帮助，通过对磁共振纹理特征的认识，克服了人类肉眼对于评估肿瘤的局限性。同时，计算机辅助技术通过定量地提取和肿瘤异质性相关的参数，量化了纹理分析结果。

不同分子表型的GBM，可以反映机体的不同生物学状态及进程［16-18］。在颅内胶质瘤中，肿瘤基因的活性与肿瘤细胞遗传表型的起源区域是相关的。换言之，在胶质母细胞瘤中MGMT 甲基化与否和MGMT 启动子甲基化突变的起源及遗传学改变有关。分子遗传学的改变导致胶质母细胞瘤中不同基因表型的表达，从而形成MRI 图像上信号的差异。

由于本研究属于单中心研究，样本例数较少，可能导致出现选择偏倚，需要多中心合作来验证本研究的结果。本研究只采用了T1WI 增强图像，并没有使用其他序列的图像。