天津沿海牡蛎的形态学观察及分子鉴定

于帅，刘利华，李永仁，郭永军，陈丽梅

（天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）

牡蛎（Concha Ostreae）分类学上隶属软体动物门（Mollusca），双壳纲（Bivalvia），珍珠贝目（Pterioida），牡蛎科（Ostreidae），又被称为蚝、海蛎子等[1]。牡蛎分布很广，除寒带的某些特别地区外，热带、亚热带、温带和亚寒带均有分布[2]。在中国，主要分布在从渤海、黄海向南至南沙群岛的各个海区[3]。牡蛎肉质鲜美，具有丰富的营养价值，更被誉为“海中牛奶”，并且牡蛎具有生长迅速、产量高等优点，牡蛎成为世界各国重要的海水养殖对象之一[1]。

天津市地处于渤海湾西北部，海岸线从南部的歧口到北部的涧河口，长约153千米[4]，历史上天津大神堂海域曾经是渤海湾贝类的重要栖息场所，形成了以活体牡蛎礁为基础的独特生态系统[5]。随着经济快速发展和开发力度逐步加大，天津沿海海域面临着环境污染和过度捕捞的严重威胁，贝类资源持续衰退。目前关于天津沿海牡蛎的分布及种类组成尚没有详细报道，其背景信息亟待阐明。传统的分类方法主要是基于牡蛎的贝壳形态，但由于牡蛎的生活习性为营固着生活，使得外壳易受环境变化影响而造成误差和混淆[6]。因此，为了探明天津海域牡蛎的物种多样性，本研究在天津沿海设置3个采样点进行牡蛎样品采集，在形态学鉴定的基础上，采用分子手段进一步确定，以期明确天津沿海牡蛎的分布和种类，为天津地区的贝类物种多样性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用牡蛎于2019年7月2日、3日和11日分别采集于独流减河口（坝上、滩涂、礁石）、北疆电厂防波堤与东疆港礁石，遵循随机原则进行采样，采样时不分大小，共采集野生牡蛎样本127个。采样点具体信息见表1。

1.2 样本形态特征鉴定及保存

将采集到的野生牡蛎外壳表面的泥沙清洗干净，用游标卡尺测量牡蛎的壳长、壳宽、壳高，电子天平称量牡蛎的总重和鲜肉重。

测量完毕后，对牡蛎贝壳的各部分特征进行观察记录，包括壳型、壳表、壳内颜色、鳞片形状、放射肋分布情况以及闭壳肌痕形状、颜色等。

通过形态特征对牡蛎进行初步鉴定。选取具有典型性外壳特征的牡蛎样本，对其内壳和外壳分别进行拍照记录。样品牡蛎按采集地点和区域分为5组，从每一组别中挑选4个外壳形态差别较大的个体，取牡蛎样品闭壳肌，-20 ℃冷冻储存备用。

1.3 基因组DNA提取和COI基因扩增

1.3.1 基因组DNA提取

使用动物组织基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）按照操作步骤提取牡蛎闭壳肌组织DNA。样品DNA使用超微量分光光度计（Nanophotometer N60）检测核酸浓度，并于-20 ℃保存备用。

1.3.2 目的基因PCR扩增

牡蛎 COI序列扩增所用的引物为通用引物LCO-1 490（5＇-GGTCACAAATCATAAAGATATT GG-3＇）和 HCO-2 198（5＇-TAAACTTCAGGGT GACCAAAAAATCA-3＇）[7]。PCR 反应体系为 25 μL，其中包括 0.2 μmol/L引物、50～70 ng DNA模板、2×PCR buffer、2 mmol/L dNTPs、1.5 μmol/L MgCl2和2U Taq聚合酶（Takara）。循环参数如下：预变性95 ℃加热5 min，变性 95 ℃ 30 s，引物退火51 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，循环数30，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检验。其中引物合成及测序工作交由生工生物（上海）股份有限公司进行。

1.4 序列数据处理

使用 Clustal X[8]软件结合人工校对进行多序列对比，校正序列后使用NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行核酸序列同源性比对。使用DnaSP 5软件对牡蛎样本的单倍型数目（Haplotype，H）、单倍型多样性（Haplotype diversity，h）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，π）等进行结果分析。在Genbank中选择巨蛎属的9条序列，以Ostrea chilensis为外群（表2），进行聚类分析，采用 MEGA7软件中的邻接法（Neighbor- joining，NJ）构建系统进化树。

表2 从GenBank数据库中下载COI基因序列信息

2 结果与分析

2.1 牡蛎形态特征分析

本次采集的牡蛎样本经形态特征初步鉴定后，全部为一个种类——长牡蛎（图1）。采集到的样本牡蛎个体基本中等大小，壳高为壳宽的2.5倍左右，存在个别个体相对较大的情况。其中在独流减河口滩涂处采集的样本个体较大，在北疆电厂防波堤采集的牡蛎样本普遍较小，详细的牡蛎形态特征参数见表3。

图1 牡蛎样本图片

表3 牡蛎形态特征参数

在3个地点采集的牡蛎样本外壳形态基本一致，绝大多数壳形为长型，少数壳形为近圆形。壳表颜色大多为褐色、黄褐色等。样本左壳较大而且呈现凹陷状，右壳稍小较平。壳面鳞片不明显，有些个体壳表鳞片为波纹状，层次稀疏，放射肋不明显，壳内表面大部分为白色，个别壳内为黄色。壳顶腔较深，韧带槽较长，闭壳肌痕大多为黄色、褐色等，近圆形或马蹄形状。

2.2 牡蛎COI序列分析

2.2.1 COI序列对比结果

20个牡蛎样本经测序后获得16条可用序列，利用Clustal X[8]软件进行比对之后，进行人工校对剪切后序列长度为578 bp。经软件分析，16个个体中存在9个单倍型（H），单倍型多样性（h）为0.767，核苷酸多样性（π）为0.001 73。使用NCBI网站上的Blast程序进行核酸序列同源性比对，结果表明所测牡蛎样本确为长牡蛎，支持形态学鉴定结果。在16条序列中共有8个碱基位点发生变异，分别是216 bp处（M4）、163 bp处（M6）、81 bp处（M9）、169 bp处（M10）、17 bp处（M14）、30 bp处（M16）、444 bp处（M17）和558 bp处（M20）。

2.2.2 系统发育分析结果

将本研究得到 COI基因序列的 9个单倍型（M3、M4、M6、M9、M10、M14、M16、M17和 M20）和巨蛎属的9条序列构建系统发育树，结果如图2所示。9个单倍型与长牡蛎C.gigas（FJ717 608）聚为一支，结合长牡蛎的形态特征，确定本研究采集的牡蛎样本为长牡蛎。9个单倍型、长牡蛎C.gigas（FJ717 608）与福建牡蛎C.angulata（KX579 091）先聚为一支，再与熊本牡蛎C.sikamea（AB904 878）聚为一支，说明其亲缘关系较近。

图2 基于牡蛎 COI 基因使用邻接法（NJ）构建的系统发育树

3 讨论

3.1 天津沿海牡蛎种类组成

结合形态学特征与COI基因鉴定结果，得出本研究采集的牡蛎种类均为长牡蛎。长牡蛎（Crassostrea gigas）又称为太平洋牡蛎，隶属于软体动物门（Mollusca），双壳纲（Bivalvia），翼形亚纲（Pterimorphia），珍珠贝目（Ostreoida），牡蛎科（Ostreidae），巨蛎属（Crassostrea），属于牡蛎种类中体型较大的一种，具有广盐、广温性，广布于中国、韩国和日本沿海海域，其主要集中栖息在低潮线附近至20 m 深处，在浅海的岩礁及潮间带上天然分布，在河口生态系统中发挥着重要作用。长牡蛎作为国内牡蛎养殖的主要品种，拥有营养丰富，出肉率高、适应能力强、生长速度快等特点[9-10]，经济价值较高，我国辽宁、山东、江苏、浙江、福建等沿海地区均为长牡蛎的主要养殖区域[11]。

本研究在3个采样点采集的样本均为长牡蛎，说明天津沿海牡蛎的物种多样性比较单一。薛春汀[12]在对天津宁河区俵口距今 5 000年左右的牡蛎礁进行调查时发现，牡蛎礁的主要品种为长牡蛎，含有少数近江牡蛎，但是近些年的报道中均未发现近江牡蛎存在。黄津伟等[10]还发现天津汉沽大神堂潮间带区域存在猫爪牡蛎，但由于此次采样地点未包括此地，故并未发现该种类。因此我们认为，进一步对大神堂潮间带及活体牡蛎礁进行调查取样，能够得出更全面的结论。此外，在本研究的3个采样点中，独流减河口滩涂上采集的牡蛎个体最大，北疆电厂防波堤上采集的个体最小。并且在独流减河口坝上、滩涂和礁石三个区域同时采集的样本中，个体大小顺序为：滩涂＞礁石＞坝上，说明在不同的生存环境中，牡蛎的生长情况也存在一定差异。

本研究探明天津沿海牡蛎的种类和分布情况，对研究天津现生牡蛎资源状况以及生物多样性的保护具有重要意义，为野生牡蛎的种质资源保护和合理开发提供了数据参考。

3.2 COI基因在牡蛎物种鉴定中的应用

物种鉴定是生物研究和保护工作的基础，以往的贝类鉴定主要是依据形态学特征进行，如张玺等[13]参照1928年以来搜集的标本以及国外的资料，根据牡蛎的外部形态特征、内部解剖结构、生态习性和分布区域等把我国沿海牡蛎分为1属、4亚属、13种。李孝绪等[14]通过对中国沿海15种牡蛎的比较解剖学研究，将其分为2个科、4个亚科、10属。但由于牡蛎的外壳易受环境变化的影响，仅依靠外形特征鉴定对于某些种类存在一定困难，如多名学者曾将中国北方沿海常见的长牡蛎种类认定为褶牡蛎（Crassostrea plicatula）或僧帽牡蛎（Saccostrea cuccullata）[13-14]。王海艳等[15]在形态学分类的基础上，利用COI、16S rRNA等基因序列对中国北方沿海典型海区的“褶牡蛎”重新进行了系统分类学研究，并与Genbank的牡蛎序列进行聚类分析，结果证明中国北方沿海礁石上分布的牡蛎与C.gigas聚为一支，确认应为长牡蛎。由于COI基因片段具有结构简单、富含系统发育信号、较高的多态性、易被通用引物扩增及较高的物种鉴定可靠性等特点[16]，近些年来在贝类分类鉴定中发挥了越来越大的作用，崔宗梅等[17]利用COI基因对广东雷州半岛东部沿岸潮间带的牡蛎进行鉴定，指出至少有 5种牡蛎分布于潮间带，其中熊本牡蛎和福建牡蛎为优势种。李翠等[18]利用COI基因对广西沿海牡蛎进行物种鉴定，表明广西沿海牡蛎物种丰富，至少7种牡蛎分布于潮间带，其中优势种为猫爪牡蛎和熊本牡蛎。本研究中根据已有报道[7]使用通用引物LCO-1 490和HCO-2 198进行COI基因序列扩增，重复性高，效果较好。说明应用COI基因序列进行天津沿海牡蛎鉴定是可行的。由于在不同区域采集的样本中，牡蛎的形态差别较大，利用COI基因结合外形形态特征进行鉴定，有助于得出更加准确的结论。