基于网络药理学和分子对接探究涤痰汤治疗冠心病的作用机制

王朕 刘光辉 王洋

[关键词]涤痰汤；网络药理学；冠心病；分子对接；作用机制

冠心病（coronaryheartdisease，CHD）是一种缺血性心肌病，CHD可引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血、缺氧或坏死。CHD中医又称“胸痹心痛”，出自《灵枢·经脉》，由多种原因引起瘀血、寒凝、痰浊、气滞痹阻心脉。痰浊是气机失调或血行不畅引发的病理产物，近现代医家多从痰浊辨证治疗胸痹心痛，杨关林教授团队研究结果表明，痰浊贯穿于胸痹心痛的整个病程[1]。涤痰汤出自明代董宿《奇效良方》卷一，具有补虚豁痰，清热利气之功，善于治疗动脉粥样硬化痰浊瘀阻证。现代研究证实涤痰汤治疗CHD稳定型心绞痛具有显著临床效果[2]。涤痰汤关于CHD的治疗研究已经进入分子水平[3]，但缺少基于网络药理学分析涤痰汤治疗CHD作用机制的研究。本研究通过筛选交集靶点，进行富集分析、分子对接技术，将前期预测靶点和活性成分进行对接验证，探讨涤痰汤治疗CHD的生物分子作用机制，为今后学者使用该方治疗CHD及相关疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 涤痰汤药物活性成分及其作用靶点的筛选

通过检索中药系统药理学数据库[4]检索涤痰汤9种中药的化学活性成分，根据类药性（DL）≥0.18，口服利用度（OB）≥30%筛选获得中药活性化合物。在Uniprot蛋白质数据库将其转化为基因靶点进行规范。

1.2 差异基因（DEGs）的筛选与处理

从高通量基因表达数据库获得编号GSE71226基因芯片的原始数据及对应的GPL基因注释文件，使用在线分析工具GEO2R筛选出CHD和正常人的差异基因。导入在线绘图平台，以表达差异检验P<0.05、表达倍数（FC）绝对值>2为条件，导出差异基因并绘制热图及火山图。

1.3 CAD相关靶点获取及维恩图的绘制

以“coronaryheartdisease”为关键词，在Drugbank、OMIM和GeneCards数据库筛选取并集，获得本研究使用CHD疾病靶点绘制维恩图。

1.4 涤痰汤成分-CHD靶点PPI网络

将1.3获得疾病靶点与药物靶点取交集，得到CHD-涤痰汤有效成分交集靶点。使用Cytoscape3.8.2软件得到“中药-活性成分-基因靶点”网络图。

1.5 基因本体（geneontology，GO）功能富集分析

使用metascape和David数据库，选择物种信息为人，导出富集通路信息，进行可视化富集分析。

1.6 基因组百科全书（kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集分析

通过metascape和David数据库交集靶点进行富集分析。绘制气泡图发掘CHD治疗中涤痰汤作用机制。

1.7 涤痰汤处方组成-活性成分-CHD靶点-通路网络图构建

将KEGG通路富集结果导入Cytoscape3.8.2软件，获得“活性成分-靶标-通路”网络图，根据网络拓扑参数判断核心靶点前10位及发挥药效的主要活性成分。

1.8 分子对接验证

以1.7所作图中度值较大的有效成分和两个网络图靶点度值排名前10位交集的关键靶点蛋白为研究对象进行分子对接验证。

2 结果

2.1 涤痰汤活性成分的筛选

通过筛选共得到涤痰汤中有效活性化合物73个，其中人参10个、甘草20个、橘红5个、茯苓3个、胆星5个、竹茹6个、枳实12个、菖蒲4个、半夏8个。

2.2 DEGs的筛选与处理

GSE71226共含基因45119个。log2FC>0為上调基因，反之为下调基因，绘制火山图，见图1。以FC绝对值>2、P<0.05为条件筛选到正常组和CHD组差异基因3473个，选择幅度最大的前18位基因绘制聚类热图，见图2。

2.3 涤痰汤治疗CHD的潜在作用靶点及文氏图的绘制

去重得到4511个CHD疾病基因，见图3。把交集靶点导入STRING数据库，限定物种为“人”，得到疾病药物共有靶点PPI网络图，见图4。节点度值通过文字大小节点面积来表示，度值越高的节点的面积越大，其中AKT1、RELA和HSP90AA1可能是涤痰汤治疗CHD重要靶点。

2.4 药物-成分-靶点PPI网络图

涤痰汤治疗CHD的“中药-活性成分-基因靶点”网络图，见图5。网络中所有成分均对应2个以上靶点，说明涤痰汤发挥作用是“多成分、多靶点”共同的结果，符合我国中医药辨证、辨病、辨症相结合治疗疾病的特点。研究方剂涤痰汤的核心成分，按度值进行排序，前3位为去山柰酚（度值=125）、β-谷甾醇（度值=95）、柚皮素（度值=93），见表1。

2.5 GO富集分析

得到GO-BP（生物过程）富集结果361条、GO-CC（细胞成分）富集结果44条、GO-MF（分子功能）富集结果66条。于BP、MF、CC中分别选出FDR值最小的10条通路，绘制富集条形图，见图6。

2.6 KEGG富集分析

得到KEGG富集结果163条。于BP、MF、CC中分别选出FDR值最小的15条通路。如图可知，CHD疾病病机是多通路共同作用的结果，KEGG主要涉及脂质与CHD、白介素17和TNF信号通路等，见图7。

2.7 涤痰汤处方组成-活性成分-CHD靶点-通路网络图构建

分析KEGG结果，构建网络。找出对应靶点和有效成分，根据度值、介度及紧密度大于阈值筛选。获得关键靶点47个，见表2。可视性优化（图8）。找出药效作用的主要成分及核心靶点。结果显示主要成分为豆甾醇、β-谷甾醇、柚皮素、山柰酚、谷甾醇和槲皮素等。核心靶点前10个为：RELA（16）、AKT1（15）、JUN（15）、CASP3（14）、MAPK1（12）、MAPK3（12）、HSP90AA1（12）、pTGS2（12）、pRKCA（11）、MAPK14（10）。与PPI网络的前10个核心靶点对比，有6个共同靶点。此网络体现了涤痰汤通过多靶点、多成分、多通路的方式干预CHD的特点。

2.8 分子对接验证

分子对接两者之间有一定的结合活性，则结合能≤-4.25kcal/mol；若结合活性较好，则结合能≤-5.0kcal/mol；若两者之间有强的结合活性，则结合能≤-7.0kcal/mol[5]。选取筛选得到的核心成分分别与关键靶点进行分子对接验证，计算其对接分数（表3），由表可见，其中100%的活性成分与其蛋白质靶点之间有较好的结合活性，大部分有强的结合活性，而β-谷甾醇与MAPK3的对接分数最高，为-10.2。

3 讨论

3.1 CHD成因与涤痰汤治疗CHD理论依据

心血管疾病发病率逐年上升，截至2017年，我国心血管疾病患者数量高达2.9亿人[6]。浊、毒、痰、瘀等邪气通过血液的流通对脉道产生影响，脉道变厚，血流速度变缓，血管异常收缩，形成血栓或粥样斑块[7]。有学者治疗胸痹心痛时多从调理水谷之海入手，运用祛瘀、行气、化痰、健脾等治法[8]。涤痰汤由二陈汤化裁而成，具有祛痰化瘀的功效，相关研究认为，涤痰汤能缓解CHD（痰浊瘀阻证）患者临床表现，减少血液粥样斑块，使血液流变学指标改善[9]。对治疗不稳定型心绞痛痰浊瘀阻型CHD，涤痰汤可在一定程度上提高临床预后，缓解胸痛、胸闷、心悸等症状[10]。

3.2 涤痰汤以“β-谷甾醇”等为主要活性成分治疗CHD

临床中，涤痰汤常用于急性心梗和不稳定型心绞痛痰浊瘀阻证等疾病，方中橘红理气宽中，半夏燥湿化痰。相关活性成分β-谷甾醇能发挥保护缺血再灌注损伤心肌的作用[11]。竹茹化痰止呕，枳实破气行痰，胆南星清热化痰，主要成分柚皮苷通過调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路减少脂质条纹增殖以及血管平滑肌细胞迁移[12]。炙甘草调和诸药，槲皮素是人参、甘草、竹茹等中药的主要成分之一，具有保护内皮、扩张血管、降脂等内分泌调节的作用[13]。因此涤痰汤可能通过以上药物活性成分，发挥调节胆固醇、保护心肌、降糖、调脂、抑制心肌细胞凋亡等作用。

3.3 涤痰汤以“MAPK1”等核心靶基因治疗CHD

MAPK系列在CHD的发展、心肌细胞凋亡和增殖及血管内皮细胞新生中具有重要的组织学作用。MAPK1和MAPK3是重要多通路功能蛋白，与心肌纤维化发生发展有密不可分的关系。RELA是NF-κB家族中最常见的成员，有研究表明，RELA（p65）可以通过调控人主动脉平滑肌细胞生物学机制减缓CHD的病理进展[14]。AKT信号通路在心血管系统中控制着多种细胞功能。通过Ap-1、c-JUN与Fank1、Jab1共同作用，上调下游基因Bcl-2的表达，起到抑制细胞凋亡的作用[15]。以上靶点与缓解动脉粥样硬化和心肌细胞凋亡、保护动脉重构密不可分，提示涤痰汤可能通过增强或抑制相关靶点的表达来治疗CHD。

3.4 涤痰汤治疗CHD各分类疾病涉及的生物学过程及信号通路

WHO将CHD分为5大类，其中心力衰竭是由于心脏收缩或舒张功能障碍，心脏射血不能满足机体的需要，TNF通路通过激活CASP3对凋亡因子起到抑制作用和抗凋亡因子的激活作用[16]。心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。PI3K-AKT通路通过调节NOS3的表达，调控JNK和p38，上调Bcl-2和下调Bax的表达，从而达到抗凋亡的目的。综上，对于CHD多种分型，以上靶点与通路分别通过调节抗炎和抑制细胞凋亡、抗氧化因子等机制，发挥缓解和治疗的作用。

4 小结

本研究证实了涤痰汤多靶点、多成分、多通路的中药药物作用机制。由于网络药理学、分子对接技术的局限性，后期可围绕药效学评价-物质基础代谢组学-通路验证等开展实验研究，为涤痰汤治疗CHD以及药物开发利用提供理论依据。