YTH N6-甲基腺苷RNA 结合蛋白F1 在消化系统恶性肿瘤中的研究进展△

黄杨媛，陈彩煌，米玉龙，李滨

桂林医学院附属医院消化内科，广西桂林 541000

消化系统恶性肿瘤严重威胁人类健康，国际癌症研究机构（International Agency for Reserch Cancer，IARC）、美国癌症协会（American Cancer Society，ACS）以及中国国家癌症中心的统计数据均显示其发病率及病死率较高[1-3]。对于晚期消化系统恶性肿瘤患者，一般的手术治疗效果欠佳，急切需要寻找可行的替代治疗方案。近年来分子靶向治疗和免疫治疗快速发展，精准医学对晚期肿瘤患者是一道曙光，因此探索肿瘤的发病机制仍十分必要。生物体中有多种不同的RNA 修饰，这些修饰在疾病尤其是肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[4]。腺苷的N6 位甲基化形成的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）被认为是真核生物信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）[5]及长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）中最普遍、最丰富和最保守的内部转录修饰[6]。含有YTH 功能结构域的蛋白是m6A 阅读器，YTH N6-甲基腺苷RNA 结合蛋白（YTH N6- methyladenosine RNA binding protein，YTHD）F1 是其中一员，其最主要的功能是影响m6A 修饰的基因翻译。本文对YTHDF1 在消化系统恶性肿瘤中的研究进展进行综述。

1 m6A 修饰和YTHDF1

m6A 由甲基化转移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）、m6A结合蛋白（reader）组成[7]。“writer”包括甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）及其附加亚基Wilms 肿瘤1 相关蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP）、vir 样m6A 甲基转移酶相关蛋白（vir like m6A methyltransferase associated protein，VIRMA）、锌指CCCH 型含蛋白13（zinc finger CCCH- type containing 13，ZC3H13）、Cbl 原癌基因样1（Cbl proto-oncogene like 1，CBLL1）和RNA 结合基序蛋白15/15B（RNA binding motif protein 15/15B，RBM15/15B）。脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity associated，FTO）和RNA去甲基化酶alkB同源物5（alkB homolog 5,RNA demethylase，ALKBH5）被鉴定为mRNA上的“eraser”，并且发现另一个“eraser”——ALKBH3 优先去甲基化转运RNA（transfer RNA，tRNA）中的m6A。“reader”目前是一类含有YTH 功能结构域的蛋白，存在于真核生物的174种不同蛋白质中，高度保守，由145个氨基酸组成，是非结构化N端和C 端之间的序列[8]，其主要影响m6A 修饰基因的翻译，其功能结构域的蛋白通过影响下游基因表达参与多种生物学功能，包括RNA 剪接、调控、核质转运、稳定性、翻译和降解等[9-13]。YTH 结构域的二级结构由4 个α螺旋和6 个β链组成，选择性地结合单链非结构化RNA，含有YTH 结构域的蛋白质通过由3个色氨酸残基组成的保守芳香笼识别m6A结合位点[14]。YTH 功能结构域包括哺乳动物中的YTHDF1、YTHDF2 和YTHDF3 以及YTHDC1 和YTHDC2。在YTHDF1、YTHDF2 和YTHDF3 蛋白中，86%的YTH 结构域序列相同。YTHDF1 通过与m6A 修饰基因结合诱导mRNA 翻译，从而在各种生理过程中发挥重要作用；YTHDF2 通过募集脱腺苷酸化复合物CCR4-NOT 加速其mRNA 靶标衰变，YTHDF3 促进翻译并加速目标mRNA 衰变[15]。YTHDF1 的YTH 结构域由来自C 末端的β1、α1、β2和来自N 末端的α2 及β4 和β5 之间的环组成。YTHDF1 使用由Trp411、Trp465 和Trp470 组成的m6A结合口袋特异性识别m6A位点[16]。

YTHDF1 蛋白在不同肿瘤中的生理作用不同，其功能可能特定存在于某些细胞环境。据报道，YTHDF1 对肿瘤的发展具有一定的作用，例如乳腺癌中YTHDF1 通过m6A 修饰识别并结合叉头框蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）的mRNA，并加速FOXM1的翻译过程，从而加速乳腺癌转移[17]。关于前列腺癌的研究证明了polo 样激酶1（pololike kinase 1，PLK1）是YTHDF1 的直接靶标，YTHDF1 通过识别m6A 修饰的PLK1mRNA，以m6A 依赖性方式促进PLK1的翻译，随后促进磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路过度激活[18]。此外，在头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）的研究中，YTHDF1 表达与HNSCC 的恶性表型显著相关，与CD4+T 细胞浸润呈正相关，与CD8+T 细胞浸润呈负相关，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）相关的YTHDF1 可能作为指导免疫治疗的预测性标志物[19-20]。YTHDF1 在不同肿瘤中的发生发展机制不同，所有类型肿瘤中，消化系统恶性肿瘤占比较大。

2 YTHDF1 与消化系统恶性肿瘤

2.1 YTHDF1 与食管癌

食管癌是第六大恶性肿瘤死亡原因，可分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）两种病理类型[21-22]。食管癌的发病机制仍未清晰。有学者通过分析66 例ESCC 患者的RNA 高通量测序数据结合癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库ESCC 数据集中提取的转录组数据，找出ESCC 相关的m6A 调控因子，结果提示YTHDF1 在ESCC 组织中高表达，YTHDF1 高表达与较差的生存有关，提示YTHDF1可能在ESCC 中发挥促癌基因的作用[23-24]。另一项研究报道，人类白细胞抗原复合体P5（human leukocyte antigen complex P5，HCP5）可直接与YTHDF1 相互作用，促进YTHDF1 与m6A 修饰的己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）mRNA 结合，增强HK2 的稳定性，从而促进ESCC 的Warburg 效应和进展[25]。同样，YTHDF1 通过识别m6A 修饰稳定erb-b2 受体酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）mRNA，从而促进ESCC 进展[26]。有研究提示，m6A 甲基化调节剂可能是程序性死亡配 体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，又称PD-L1）表达和免疫细胞浸润的关键介质，并可能强烈影响ESCC 的发展时间[24]。提示YTHDF1可能在ESCC 中发挥促癌基因的作用，并且在食管癌的发展进程中，YTHDF1 可能与免疫调节具有一定的联系。

2.2 YTHDF1 与肝癌

中国是原发性肝细胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）大国[27]，在五大洲中亚洲HCC 发病率较高[28]。随着乙型肝炎疫苗的普及，肝癌的发病率在年轻人中有所下降，但由于中国人口基数大，肝癌的发病例数及病死例数仍较多。m6A 修饰作为最丰富的RNA 修饰，也参与了HCC 的发展过程。有研究者发现，YTHDF1 在肝癌中表达上调，体外实验证明其可抑制AKT2和AKT3的翻译，但并不影响转录水平。有研究采用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes，KEGG）进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），结果表明，YTHDF1通过激活PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信号通路促进HCC 细胞增殖[29]。提示YTHDF1 可以通过促进肝癌细胞增殖促进肝癌的发生发展。与此同时，YTHDF1 对肝癌的影响还包括微环境及免疫逃逸。有研究通过数据分析发现，m6A 调节因子和PD-L1 可能在HCC的发生、侵袭和免疫逃逸过程中发挥重要作用[30]。也有学者报道一种新的环状RNA——circRHBDD1，其可增强有氧糖酵解，并限制HCC 的抗程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，又称PD-1）治疗疗效，该研究发现，circRHBDD1 将m6A 阅读器YTHDF1 招募到磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）mRNA 并加速其在m6A 中的翻译。真核翻译起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，EIF4A3）介导的外显子反向剪接有助于circRHBDD1 表达上调。此外，circRHBDD1在抗PD-1 应答的HCC 患者中高表达，靶向circRHBDD1 可改善免疫小鼠模型的抗PD-1 治疗疗效，提示circRHBDD1/YTHDF1/PIK3R1 信号通路在HCC 发生发展中具有重要作用[31]。另一项小鼠实验也支持YTHDF1 与免疫治疗有关，甲硫氨酸通过为RNA m6A 修饰提供甲基供体，在抗肿瘤免疫和T 细胞免疫方面发挥关键作用，同时YTHDF1 和甲硫氨酸的代谢会影响并调节免疫检查点分子的表达，通过限制甲硫氨酸饮食或YTHDF1 耗竭可抑制肿瘤生长，与PD-1 阻断剂协同作用，可更好地控制肿瘤进展[32]。以上多项研究均提示m6A 修饰中的“reader”YTHDF1 参与了HCC 的发生发展，并且与肿瘤侵袭和免疫逃逸有关。因此，深入研究YTHDF1 对肿瘤发生发展的作用，有可能为肿瘤治疗提供新的靶点。

2.3 YTHDF1 与胃癌

胃癌是第五大常见恶性肿瘤，也是恶性肿瘤相关死亡第四大原因，严重威胁人类生命健康[1]。m6A 修饰作为生物体内最常见的修饰，在胃癌的发生发展过程中同样发挥着重要作用[33]。m6A 修饰通过调节蛋白质合成和相关信号通路（如肿瘤细胞自噬、迁移、变异、增殖、上皮-间充质转化、耐药和异常糖酵解）影响肿瘤的发生发展，这预示m6A修饰是恶性肿瘤治疗的重要靶标[34-36]。YTHDF1 在胃癌发生发展过程中的作用机制仍未能十分明确。有学者通过分析TCGA 中m6A 相关基因的表达谱，并通过LASSO 逻辑模型构建了诊断m6A 的数据库，揭示了YTHDF1在胃癌中的表达变异谱，通过实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法分析17 例胃癌组织和配对的邻近正常组织以及胃癌细胞系，验证了YTHDF1在基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中胃癌数据集中的表达趋势，结果提示，YTHDF1 在胃癌中呈高表达[37]。非甾体抗炎药（包括布洛芬）在临床中的应用十分广泛，其可参与各种信号通路，例如p75 神经营养蛋白受体（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）可通过诱导细胞周期停滞和调节细胞凋亡来抑制肿瘤生长，p75NTR 的表达受表观遗传作用的影响。有学者在研究中发现，布洛芬可以通过促进YTHDF1、YTHDF3 和YTHDC2 的表达增强肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）翻译[38]。另有研究发现，YTHDF1 以m6A 依赖性方式促进WNT受体——卷曲类受体7（frizzled class receptor 7，FZD7）翻译，突变的YTHDF1可增强FZD7 的表达，导致WNT/β-联蛋白（β-catenin）信号通路过度激活并促进胃癌发生[39]。导致胃癌发生的机制非常复杂，这个过程中有多种信号通路参与，同样，微环境对于胃癌的发展也十分重要。胃癌的治疗方法包括手术、化疗和放疗[40]。免疫疗法是继手术、化疗和放疗之后的一种新型疗法[41-42]，通过诱导、增强或调节免疫反应来达到治疗效果，目前胃癌的免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂疗法[43-44]。有研究发现，m6A 的多个调节因子（包括YTHDF1）在胃癌组织中过表达，PD-L1 和PD-1 在胃癌组织中的表达水平均显著升高，且与METTL3、YTHDF1 表达显著相关[45]。有关纳米技术包裹材料治疗胃癌的研究也有十分重要的发现。研究显示，YTHDF1 缺失可介导干扰素受体1 的过表达并增强干扰素受体1的作用，促进主要组织相容性复合物Ⅰ类在肿瘤细胞上的表达，实现免疫原性肿瘤细胞的自我呈递，从而强烈刺激细胞毒性T 淋巴细胞反应。并且该研究设计了整合素相关蛋白CD47 高表达和磷脂-聚乙二醇-整合素靶向环肽[DSPE-PEG-cyclo（Arg-Gly-Asp-Tyr-Cys），DSPE-PEG-c（RGDyC）]修饰的小细胞外囊泡，用于有效递送针对m6A 的“reader”YTHDF1，通过表观遗传和免疫调节治疗胃癌，该纳米材料通过阻碍YTHDF1 控制的FZD7翻译，阻断WNT/β-catenin 信号通路，从而抑制胃癌进展和转移，这是一种表观遗传调节剂，在免疫治疗方面具有巨大潜力[46]。以上研究表明，胃癌的发生发展是由多种因素共同作用引起的，微环境及免疫调节扮演着十分重要的角色，PD-1 和PD-L1对恶性肿瘤的治疗有着确切的疗效，而YTHDF1在免疫逃逸方面的作用仍不可忽视，有待进一步深入了解。

2.4 YTHDF1 与结直肠癌

结直肠癌是不可忽视的恶性肿瘤，其病因很多，WNT 信号在不同组织的正常胚胎发育过程中起着重要作用，并调节细胞生长、凋亡和分化[47]，WNT信号通路的组成成分改变可导致结直肠癌，此外，WNT/β-catenin 信号通路与肿瘤干细胞有关[48]。有研究发现，YTHDF1 在肠癌中过表达，采用小鼠模型检测YTHDF1 在WNT 驱动的肿瘤发生中的功能，结果显示，YTHDF1 缺乏可抑制结直肠癌形成，并且肿瘤数量减少，肿瘤体积缩小，随着YTHDF1表达减少，T 细胞转录因子7 类似物2（transcription factor 7 like 2，TCF7L2）的翻译也会减少，导致WNT 信号失活和肿瘤细胞干性丧失[49-50]。与此同时，其他信号通路也影响YTHDF1 对结直肠癌的作用。有学者发现，YTHDF1 可以上调糖皮质激素调节元件结合蛋白2（glucocorticoid modulatory element binding protein 2，GMEB2）的表达，GMEB2 作为转录因子反式激活黏附调节分子1（adhesion regulating molecule 1，ADRM1）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，从而促进恶性肿瘤的发展[51]。也有研究提示，YTHDF1 通过影响Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子2（Rho/Rac guanine nucleotide exchange factor 2，ARHGEF2）翻译和ras 同源物家族成员A（ras homolog family member A，RhoA）信号通路促进结直肠癌的发展[52]。YTHDF1在结直肠癌中的作用也与微环境免疫调节相关。研究提示，YTHDF1 表达与TCGA 数据库结直肠癌数据集中的γ-干扰素基因呈负相关，并且与CD8+T细胞浸润呈负相关，表明其在肿瘤免疫微环境中具有一定的作用。YTHDF1 可通过促进p65/v-rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA）翻译上调C-X-C 趋化因子配体1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）的表达，从而通过影响CXCL1/C-X-C 趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2，CXCR2）信号通路促进骨髓来源抑制细胞的迁移，而增加的骨髓来源抑制细胞反过来会在肿瘤免疫微环境中拮抗功能性CD8+T 细胞，并且敲低YTHDF1可提高微卫星不稳定结直肠癌的抗PD-1作用，克服微卫星稳定结直肠癌的PD-1耐药性[53]。由此可见，YTHDF1 可通过不同途径参与结直肠癌的发生发展过程，其重要的分子机制是影响WNT 通路及肿瘤微环境免疫逃逸，这将是研究结直肠癌发病机制及治疗方案的显著突破点。

2.5 YTHDF1 与胰腺癌

胰腺癌被称为癌中之王，发展快、病死率高，许多患者发现时已发展至晚期，明确胰腺癌的发生发展机制十分重要。越来越多的证据表明肿瘤免疫微环境在胰腺癌的发病机制中具有关键作用[54]。胰腺癌患者表现出免疫抑制细胞增加、自然杀伤细胞活性受损、细胞毒性T 淋巴细胞失活和其他免疫细胞失调[20,55]。研究表明，m6A 调节剂在许多类型恶性肿瘤中具有诊断和预后预测作用[56-57]。一项包括YTHDF1 在内的6 个m6A 调节因子的风险评估发现，低风险评分患者对免疫检查点抑制剂的反应更高，总生存期更长[58]。m6A在DNA 双链断裂的同源重组修复中同样也发挥作用，非瑟酮（可能是一种有前途的抗肿瘤剂）通过影响ZC3H13 介导的PHD指蛋白10（PHD finger protein 10，PHF10）m6A 修饰增强了DNA 双链断裂，其中PHF10 m6A 甲基化以YTHDF1 依赖性方式降低自身的翻译。一种名为Olean-28，13β-内酰胺（B28）的齐墩果酸甲基新衍生物具抑制胰腺癌细胞生长的作用，其通过增加活性氧基团促进氧化损伤，进而导致细胞凋亡，并且B28 可通过阻断YTHDF1/谷氨酰胺酶1 信号通路促进氧化应激[59]。与此同时，m6A 的调节因子ALKBH5 可通过调节CD8+、CD4+T 细胞聚集诱导肿瘤细胞发生免疫逃逸[60]。提示微环境及免疫逃逸与m6A修饰存在一定的联系。

3 小结与展望

综上所述，m6A 修饰作为生命体中最常见的修饰，对多种肿瘤的发展具有促进作用。YTHDF1 作为m6A 修饰中的主要调节因子，主要影响被调节基因的翻译。YTHDF1在食管癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌中均呈过表达，在消化系统中是一个促癌基因。提示YTHDF1 可以成为消化系统恶性肿瘤的诊断指标，为肿瘤的早发现提供诊断依据，这是一个值得深入研究的方向。YTHDF1 通过多种途径对肿瘤的发生发展产生作用，如PI3K/AKT、WNT/β-catenin、NF-κB 信号通路等。食管癌、肝癌、胃癌、结直肠癌的研究均提示YTHDF1参与了微环境免疫逃逸机制，但胰腺癌的研究仅提示m6A 与微环境免疫逃逸密切相关，YTHDF1 的作用机制尚未十分清楚，需要进一步的深入探索。PD-1/PD-L1 免疫调节机制对于肿瘤患者的精准治疗十分重要，而免疫调节机制又具有个体差异性，因此需要继续探索YTHDF1 在微环境免疫调节机制中发挥的作用，其在肿瘤患者的精准治疗中有着广阔的应用前景。