zeste 基因增强子同源物2 与卵巢癌关系的研究进展△

盖敏雪，刘鸣，李长忠

1山东大学齐鲁医学院，济南 250000

2山东省立医院妇科，济南 250000

3北京大学深圳医院妇产科，广东深圳 518000

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，其病死率较高，近年来引起了人们的广泛关注。据统计，全球每年约有20 万女性死于卵巢癌[1]。由于卵巢癌早期发现困难，超过75%的患者确诊时发展为晚期，5 年生存率不到30%[2]。因此，探索卵巢癌发生发展及耐药的确切机制是迫切需要解决的问题。zeste 基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是表观遗传修饰因子之一，是多梳抑制复合体2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的成员之一，通常参与转录抑制。EZH2 是PRC2的催化亚基，可以通过催化组蛋白3 上赖氨酸27的三甲基化来改变基因表达[3]。在卵巢癌中，EZH2 通常过表达，因此可能成为有效的治疗靶点。本文对EZH2 与卵巢癌发生发展及耐药的关系进行综述，重点描述其介导细胞代谢新途径，以及与微小RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的相互作用，还强调了其与铂类耐药的关系及与多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP- ribose）polymerase，PARP]抑制剂的相互作用。

1 EZH2 的结构与功能

EZH2 是PRC2 的催化亚基，PRC2 包含EZH1和EZH2 两个催化亚基，EZH2位于染色体7q35。EZH2 蛋白包含4 个高度保守的结构域，其中SET结构域可催化组蛋白3 上赖氨酸27 的三甲基化。EZH1 和EZH2 有部分功能重叠，但EZH1 和EZH2的不同之处在于，PRC2-EZH2 在快速增殖的细胞中较为丰富，它能够催化组蛋白3 上赖氨酸27 的三甲基化，形成H3K27me3，从而诱导靶基因的转录抑制；而PRC2-EZH1 经常存在于未分裂的细胞中，负责恢复EZH2的转录抑制[4]。EZH2 在多种恶性肿瘤中表达上调，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤，已被证明在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、新生血管生成和化疗耐药中发挥关键作用[5-6]。

2 EZH2 参与卵巢癌发生发展的机制

2.1 EZH2 与IncRNA

lncRNA 在卵巢癌发生发展过程中的作用已引起研究者的广泛关注，其参与了卵巢癌的多种生理和病理过程。Zhang 等[7]研究探讨了EZH2 介导的人αβ水解酶结构域蛋白11（abhydrolase domain containing 11，ABHD11）反义RNA1（ABHD11 antisense RNA 1，ABHD11-AS1）启动子在卵巢癌发病机制中的作用，该研究证实了H3K27me3 与ABHD11-AS1 启动子的结合部位，ABHD11-AS1 在卵巢癌组织中表达显著上调，其表达水平与卵巢癌的淋巴结转移、肿瘤分期及患者的3 年生存率密切相关；敲低ABHD11-AS1 可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。该研究还表明，miRNA-133a-3p 过表达可显著增强ABHD11-AS1基因敲除对卵巢癌细胞恶性特征的影响，而miRNA-133a-3p 表达恢复则可消除ABHD11-AS1 基因过表达对卵巢癌细胞生长和转移的影响。表明EZH2 可能通过miRNA-133a-3p 介导H3K27me3 与ABHD11-AS1启动子结合，从而调控卵巢癌的进展。

UNC5B 反义RNA1（UNC5B antisense RNA 1，UNC5B-AS1）是新发现的一种在甲状腺乳头状癌中致癌的lncRNA，但其在卵巢癌中的作用尚不清楚。Wang 等[8]研究探讨了UNC5B-AS1 在卵巢癌中的作用及机制，通过基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）发现，在卵巢癌样本中UNC5B-AS1 表达上调，并经定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR）证实，UCN5B-AS1 的缺失抑制了卵巢癌细胞增殖并促进了细胞凋亡。该研究还发现，UNC5B-AS1 能够与EZH2 相互作用，触发N-myc 下游调控基因NDRG家族成员2（NDRG family member 2，NDRG2）启动子上的H3K27me3，并在表观遗传水平抑制NDRG2的表达。说明UNC5B-AS1 通过EZH2 调节NDRG2 上的H3K27me3，从而促进卵巢癌发展，提示UNC5B-AS1 是治疗卵巢癌的潜在分子靶点。

Chen 和An[9]的研究发现，与癌旁正常组织相比，卵巢癌组织中lncRNA ATB表达升高，且其高表达与卵巢癌患者的预后不良有关；沉默lncRNA ATB 的表达可抑制卵巢癌SKOV3 和A2780 细胞增殖、迁移和侵袭；RNA 免疫沉淀和RNA 下拉实验表明，lncRNA ATB通过直接与EZH2相互作用正向调节EZH2的表达，从而促进卵巢癌的发生发展。

氯胺酮被广泛用于治疗癌因性疼痛，并已被证明能够抑制多种肿瘤的生长，然而其对卵巢癌细胞影响的报道甚少。Li 等[10]研究发现，氯胺酮对6种卵巢癌细胞株的增殖有明显的抑制作用，并可诱导卵巢癌细胞周期停滞、凋亡，该研究还对基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库进行了生物信息学分析，发现氯胺酮能够调节lncRNA 浆细胞瘤变异体易位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）表达，还可促进p300 介导的PVT1 启动子中H3K27 乙酰化激活，PVT1 能够与EZH2 结合，并调节包括p57在内的靶基因表达，从而改变卵巢癌细胞的生物学特性。

2.2 EZH2 与环状RNA（circuIar RNA，circRNA）

Yang 等[11]研究发现，hsa_circ_0026123 在卵巢癌组织和细胞系中表达上调，而沉默hsa_circ_0026123 的表达能够抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移，并抑制体内和体外肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）相关标志物的表达；应用荧光素酶报告基因检测系统分析hsa_circ_0026123、miRNA-124-3p 与EZH2的相关性，结果表明，hsa_circ_0026123表达下调通过miRNA-124-3p 的“海绵体机制”抑制EZH2 的表达，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移，该方法可用于卵巢癌的靶向治疗。

2.3 EZH2 与miRNA

miRNA let-7b 是一种有效的肿瘤抑制因子，Kuang 等[12]研究发现，赖氨酸去甲基化酶2B（lysine demethylase 2B，KDM2B）通过使H3K36me2 去甲基化直接抑制let-7b 的表达；增殖、迁移和伤口愈合实验表明，let-7b 能够抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移，EZH2沉默逆转了抑制let-7b 介导的促肿瘤生长作用。因此，在卵巢癌中let-7b 的表达受到KDM2B 高表达的表观遗传学抑制，let-7b 的缺失上调了EZH2 的表达，从而促进了卵巢癌细胞的体内外生长。Wu 等[13]研究发现，EZH2 通过招募H3K27me3 促进miRNA-139 启动子甲基化，从而抑制miRNA-139 的表达，而沉默EZH2则通过增加miRNA-139 的表达抑制体外肿瘤的进展；miRNA-139 靶向抑制溶血磷脂酸受体1（lysophosphatidic acid receptor 1，LPA1）和LPA1 激活的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路是EZH2 作用于卵巢癌细胞的关键机制。

2.4 EZH2 与细胞代谢

EZH2 可以催化组蛋白3 上赖氨酸27 的三甲基化，从而诱导靶基因的转录抑制，这是EZH2 在肿瘤细胞中发挥作用的公认经典机制。然而，H3K27me3 通常在卵巢癌中表达缺失，这与EZH2作为H3K27me3 甲基转移酶的致癌作用相矛盾。Chen 等[14]研究发现，EZH2 高表达但H3K27me3 水平低的卵巢癌患者的预后最差，异柠檬酸脱氢酶2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH2）是三氯乙酸循环中催化α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）产生的重要酶，该研究证明EZH2 通过氧化磷酸化直接促进IDH2的转录，从而增强卵巢癌细胞的葡萄糖代谢。该研究发现了EZH2 促进卵巢癌发生发展的新机制，为后续卵巢癌联合治疗新策略的研发提供了重要的理论基础。

2.5 EZH2 与细胞免疫

卵巢癌的预后与肿瘤内淋巴细胞的存在直接相关。Spiliopoulou 等[15]研究发现，同时抑制组蛋白甲基转移酶G9A 和EZH2 的表达可以激活CXC 趋化因子配体10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）/CXC 趋化因子受体3（C-X-C motif chemokine receptor 3，CXCR3）信号通路，增加肿瘤内效应淋巴细胞和自然杀伤细胞的归巢，同时抑制促瘤的叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）+CD4 T 细胞；G9A/EZH2 双重抑制剂HKMTI-1-005可诱导染色质改变，导致免疫刺激基因网络的转录激活，例如内源性逆转录病毒K 家族（endogenous retroviruses of the K family，ERV-K）重新表达；HKMTI-1-005 治疗减轻了卵巢癌小鼠的肿瘤负荷，并提高了存活率。这些结果表明，在卵巢癌中抑制G9A 和EZH2 的表达可以改变免疫微环境，抑制肿瘤生长，这为临床治疗策略的制订提供了新思路。

2.6 EZH2 促进铂类耐药

miRNA-506-3p 过表达后，多种卵巢癌细胞中EZH2mRNA 和蛋白表达均有所下降。Sun 等[16]研究表明，miRNA-506-3p 过表达可使卵巢癌细胞对PARP 抑制剂或顺铂敏感；敲低EZH2的表达后，经奥拉帕利或顺铂处理的卵巢癌细胞的增殖能力明显下降；过表达EZH2 后，miRNA-506-3p 对奥拉帕利和顺铂敏感性的影响可以完全被逆转；过表达EZH2 的卵巢癌细胞中β-联蛋白（β-catenin）表达水平升高，相反，EZH2干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）转染降低了β-catenin 的表达；在原位卵巢癌小鼠模型中，PARP 抑制剂和顺铂对由miRNA-506-3p 介导的EZH2 和β-catenin 表达下调更具敏感性。以上结果提示，miRNA-506-3p 通过靶向EZH2/β-catenin 信号通路增强卵巢癌对PARP 抑制剂和顺铂的反应，这为miRNA-506-3p 过表达用于卵巢癌的治疗开辟了新的可能性。Zhang 等[17]在耐顺铂的卵巢癌细胞株SKOV3/DDP 和A2780/DDP 中发现，HOX 转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）表达上调，而miRNA-138-5p 表达下调，HOTAIR 基因敲除可增加顺铂耐药细胞中miRNA-138-5p 的表达，增强顺铂耐药细胞的化疗敏感性，并降低EZH2 和组蛋白去乙酰化酶1（sirtuin 1，SIRT1）的表达。此外，miRNA-138-5p 抑制剂可减弱因HOTAIR 沉默诱导的顺铂耐药细胞的化疗敏感性。该研究证实了HOTAIR 可以通过抑制miRNA-138-5p 的表达，阻止其与EZH2 和SIRT1 结合，从而促进卵巢癌细胞对顺铂耐药。

卵巢癌干细胞（ovarian cancer stem cell，OCSC）在肿瘤治疗结束后的持续存在可能是耐药肿瘤出现的原因。EZH2 在OCSC 中过表达可能有助于化疗耐药。Wen 等[18]将卵巢癌细胞系SKOV3 注射于裸鼠皮下，并定期将顺铂注入肿瘤，待肿瘤生长至一定体积时，消化获得的肿瘤移植单细胞悬液，培养一段时间后将细胞再次注射到裸鼠体内重复传代，直至在顺铂处理的第三代异种移植物中获得了一株富含OCSC 的细胞系SK-3rd。利用高通量PCR 和生物信息学方法筛选与OCSC 干性相关的EZH2 靶标，发现检查点激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）是参与CSC 特性形成的EZH2 的靶基因。该研究建立了EZH2基因敲除的SK-3rd卵巢癌细胞系，EZH2基因敲除降低了CHK1 的表达，而CHK1 过表达逆转了EZH2基因抑制肿瘤细胞球体形成和化疗耐药的作用。此外，EZH2 还与卵巢癌细胞的CHK1启动子结合并激活CHK1 信号。在临床试验中，EZH2 和CHK1 水平高的卵巢癌患者对铂类药物更具耐药性，预后也更差。上述研究表明，EZH2 通过激活CHK1 信号在维持OCSC 干性和化疗耐药中发挥关键作用。此外，Zong 等[19]研究发现，DAB2 相互作用蛋白（DAB2 interacting protein，DAB2IP）在上皮性卵巢癌细胞系中表达缺失上调了干细胞相关基因的表达，并诱导了非CSC 向CSC 转化，而DAB2IP 表达上调则抑制了CSC 的特性。生物信息学分析和反相蛋白质阵列进一步证明，DAB2IP 通过下调重要的干性诱导因子Wnt 家族成员5B（Wnt family member 5B，WNT5B）的表达来抑制WNT 信号转导。WNT5B 下游靶基因c-Jun可激活非规范的WNT 信号，而Rac 家族小GTP 酶1（Rac family small GTPase 1，RAC1）是c-Jun 激活的重要调节因子，通过抑制RAC1，WNT5B 通路可被阻断。联合应用EZH2 抑制剂GSK126 和RAC1 抑制剂NSC23766，在体外抑制了OCSC 的存活，在体内抑制了肿瘤生长并提高了其对铂类药物的敏感性。因此，以EZH2/DAB2IP/c-Jun 信号通路为靶点是预防卵巢癌复发的一种有前景的策略。

Xiong 等[20]对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1,6-bisphosphatase 1，FBP1）和EZH2基因序列的分析证实，FBP1和EZH2的表达在卵巢组织中呈正相关。应用FBP1 和EZH2 抗体进行的免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）实验证实了FBP1 和EZH2 在卵巢癌细胞中相互作用。FBP1基因敲除抑制了裸鼠肿瘤的形成和卵巢癌细胞对顺铂的耐药，并显著降低了EZH2mRNA 和蛋白表达水平。作为EZH2 的下游靶点之一，H3K27me3蛋白表达也因FBP1基因敲除而显著下调。qRTPCR、蛋白质印迹法（Western blot）和免疫组织化学染色结果均表明，FBP1敲低组移植瘤中EZH2 和H3K27me3 的表达强度均弱于对照组。这些结果提示，FBP1 通过上调EZH2 和H3K27me3 的表达来增加卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。

2.7 EZH2 与其他因子的相互作用

有研究指出，GEPIA 数据库中细胞分裂周期相关蛋白7（cell division cycle associated 7，CDCA7）在卵巢癌患者卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中的表达均升高，该现象已通过Western blot 和qRT-PCR进一步证实；将短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）CDCA7 导入SKOV3 细胞进行功能实验，结果发现，CDCA7沉默抑制了卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并使细胞周期受阻。GeneMANIA 数据库分析和Co-IP 实验验证了CDCA7 与EZH2 之间的相互作用，CDCA7 表达下调通过抑制EZH2的表达抑制血管生成，这为卵巢癌的治疗开发了一个有前景的分子靶点[21]。此外，Wang 等[22]发现染色质域解旋酶DNA 结合蛋白4（chromodomain helicase DNA binding protein 4，CHD4）在卵巢癌细胞转移过程中发挥重要作用。在卵巢癌组织中，CHD4 高表达与患者的预后不良有关。CHD4 在卵巢癌细胞中的功能丧失可抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和Western blot探索CHD4的调控机制，发现CHD4基因敲除抑制了EZH2 的表达和βcatenin的核积聚，还抑制了卵巢癌细胞的转移，并阻止了小鼠模型的疾病进展。另有研究证明，EZH2可以通过N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）参与卵巢癌的抗失巢过程，从而促进卵巢腺癌腹腔转移，EZH2在卵巢癌大网膜转移组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织[23]。抗失巢的形成被认为是原发恶性肿瘤转移过程中的关键步骤。该研究建立了卵巢癌细胞失巢模型和裸鼠异种移植瘤模型，发现降低EZH2的表达水平可在体外抑制m6A的表达并抑制卵巢癌细胞的抗失巢，还可在体内抑制卵巢癌进展。黄芩素是从多年生草本植物黄芩中发现的一种黄酮类化合物，在多种人类恶性肿瘤中具有抗肿瘤活性。Lang等[24]研究探讨了黄芩素对卵巢癌的影响发现，其抑制了卵巢癌细胞A2780和SKOV3的存活、迁移和侵袭，并减少了EZH2在卵巢癌细胞中的表达。此外，叉头框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）在卵巢癌组织和细胞中表达下调，并受EZH2的负调控。同时，黄芩素还能抑制体内肿瘤的生长和转移。该研究还发现，黄芩素可以通过调节EZH2/FOXO1 信号通路抑制卵巢癌的发生发展。Han等[25]研究发现，在高级别浆液性卵巢癌中，特异性的细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）抑制剂抑制了EZH2在T416位点的磷酸化，进而激活其下游靶基因雌激素受体（estrogen receptor，ER）α的表达。因此CDK2 抑制剂和他莫昔芬联合应用可发挥显著的协同抗肿瘤作用。

3 EZH2 抑制剂用于卵巢癌的治疗

3.1 EZH2 抑制剂与PARP 抑制剂

虽然EZH2 和PARP 分别具有不同的作用机制和功能，但EZH2 和PARP 在DNA 损伤、细胞周期等方面具有一些共同特征[26]。因此，PARP 抑制剂和EZH2 抑制剂可能具有协同或拮抗作用。Karakashev 等[27]研究表明，EZH2 抑制剂可上调有丝分裂阻滞缺陷2 样蛋白2（mitotic arrest deficient 2 like 2，MAD2L2）的表达，并以共激活相关精氨酸甲基转移酶1（coactivator associated arginine methyltransferase 1，CARM1）依赖的方式使无同源重组缺陷（homologous recombination-proficient，HRp）的上皮性卵巢癌对PARP 抑制剂敏感。CARM1 通过甲基化MAD2L2启动子上交配型转换（mating type switching，SWI）/蔗糖不发酵（sucrose non-fermenting，SNF）复合体的BAF155 亚基，推动亚基从SWI/SNF 复合体到EZH2 的转换，从而促进MAD2L2沉默。EZH2 抑制剂通过上调MAD2L2 的表达减少DNA 末端切除，从而增加非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）和染色体异常，最终导致HRp 的细胞在PARP 抑制剂处理后发生有丝分裂灾变。以上研究证明EZH2 抑制剂使CARM1高表达并使HRp 的卵巢癌细胞对PARP 抑制剂敏感，其中值得一提的是EZH2 与PARP 在肿瘤免疫微环境中具有相关性。Pantelidou 等[28]对体外乳腺癌细胞的分析结果表明，PARP 抑制剂激活了环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）/干扰素反应刺激因子cGAMP 相互作用因子1（stimulator of interferon response cGAMP interactor 1，STING）通路，体内实验进一步表明PARP抑制剂可诱导STING/TANK 结合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）/干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）通路激活，从而帮助树突细胞识别肿瘤抗原，进一步募集和激活CD8+T 细胞，而EZH2 抑制剂也被证明能够促进STING 通路介导的T 细胞渗透和抗肿瘤作用[29-30]。以上结果表明，EZH2 抑制剂和PARP 抑制剂可能在调节肿瘤免疫微环境的过程中发挥协同作用。但Yang 等[31]研究发现，PARP抑制剂联合EZH2抑制剂可促进小鼠体内肿瘤相关巨噬细胞向具有促肿瘤作用的M2型巨噬细胞分化，并促进肿瘤新生血管生成。说明EZH2 抑制剂联合PARP 抑制剂会对肿瘤微环境中的免疫细胞产生负面影响。一方面，EZH2 抑制剂可以促进免疫细胞在肿瘤微环境中的渗透，从而增强PARP 抑制剂的抗肿瘤效果。另一方面，这两种药物的联合会扰乱肿瘤的免疫微环境。因此，在卵巢癌中，这两种药物的联合应用亟待进一步研究。

3.2 EZH2 抑制剂的研发

目前一些小分子EZH2 抑制剂DZNep、SHR2554、CPI-169、CPI-1205、他泽司他（Tazemetostat）、伐美妥司他（Valemetostat）和GSK2816126 等在淋巴瘤、骨髓瘤、恶性胸膜间皮瘤、上皮细胞肉瘤、前列腺癌等肿瘤治疗中已进入临床试验阶段。DZNep 是一种S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAH）抑制剂，能够通过增加SAH 的表达间接抑制EZH2 的表达，从而抑制依赖于腺苷-L-蛋氨酸的组蛋白甲基转移酶的活性[32]。与SAM 竞争的EZH2 抑制剂如CPI-1205 和GSK2816126 目前正在淋巴瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌等肿瘤中进行临床试验。GSK2816126 对野生型和Y641 突变型EZH2具有相似的抑制效力[33]。此外，他泽司他因其出色的药效和药代动力学特性已被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于治疗上皮样肉瘤和滤泡性淋巴瘤[34]。目前临床上尚无可用于治疗卵巢癌的EZH2 抑制剂，在卵巢癌中EZH2 抑制剂还处于临床前实验阶段。新型EZH2抑制剂SKLB-03220 对突变型EZH2显示出良好的抑制活性，能够通过抑制H3K27me3 对卵巢癌细胞表现出明显的抗肿瘤作用[35]。此外，口服SKLB-0322 可以明显抑制异种移植瘤模型中肿瘤生长。可见EZH2 抑制剂是针对卵巢癌十分具有潜力的治疗药物，具有良好的应用前景。

4 小结与展望

综上所述，在卵巢癌中，EZH2 通常过表达，因此可能成为卵巢癌的治疗靶点。目前针对EZH2的多种小分子抑制剂正在陆续开发。已研发的EZH2 抑制剂在动物实验中的疗效已得到了证实，但是在临床试验中的作用有待进一步研究。靶向EZH2 或与其他治疗方法联合，是一种具有潜力的卵巢癌治疗新策略。