四川内江两种野生天冬品质及去皮前后活性成分分析

勾凤杰，李博

中国农业大学食品科学与营养工程学院（北京 100083）

天冬（Radix asparagi）是百合科植物天门冬[Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.]的干燥块根，是一种传统中药，具有养阴润燥、清肺生津的功效，主要用于肺燥干咳、顿咳痰黏、咽干口渴、肠燥便秘等症状[1]。随着中药研究的深入，人们发现天冬中含有多糖类、皂苷类、氨基酸等多种活性成分[2]，具有抗癌[3-4]、抗衰老[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、调节肠道菌群[10]、神经保护[11-12]等多种药理功效，但天冬中的活性成分含量因产地和品种的不同具有较大的差异[13-16]，因此目前对于天冬药材质量尚未有统一的评价标准。

四川省内江市是天冬的主产地之一，该地种植天冬的历史悠久，规模庞大，有“中国天冬之乡”的美誉[17]。除了大片天冬种植园外，研究人员还发现该地存在一些野生天冬，这些野生天冬生长环境偏僻，不易查寻。此研究是以此地发现的两种野生天冬为试验材料，测定其水分、灰分、淀粉、蛋白质等基础成分和多糖、皂苷、游离氨基酸等活性成分指标，从而筛选出更为优良的野生天冬品种，为其是否适合进行大规模人工栽培提供理论依据。此外，天冬药材在炮制过程中往往有“去皮”这一步骤[18]，而有研究表明天冬皮中也含有较多的活性成分，这样做会降低天冬的利用价值[14]，因此，此研究还测定了去皮前、后天冬中总多糖、总皂苷、游离氨基酸等活性成分的含量，探究去皮的操作是否会显著改变天冬中活性成分的含量，旨在为今后天冬药材的制作方法提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生鲜天冬（四川省内江市山区），于传统收获季节采挖并经由中国农业大学食品科学与营养工程学院李博教授鉴定。

C10J9Q52616标准品薯蓣皂苷元（上海源叶生物科技有限公司）；SLCJ4452氨基酸混合标准液[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]；C10421163D-无水葡萄糖（上海麦克林生化科技股份有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）；蒽酮、香兰素、福林酚（北京索莱宝科技有限公司）；浓硫酸、高氯酸、正丁醇、盐酸（分析纯，北京化工厂）；无水碳酸钠（西陇化工股份有限公司）；石油醚[现代东方（北京）科技发展公司]。

1.2 仪器与设备

DTM-4T高温马弗炉（上海儒一恒温设备中心）；DHG-9023A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；UV-5100紫外分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；KDN-04A自动凯氏定氮仪[闽测仪器设备（厦门）有限公司]；LC-15C高效液相色谱系统[岛津国际贸易（上海）有限公司]；MS204S电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理及形态特征比较

将采集到的新鲜天冬用冰袋运至实验室，待洗净晾干后进行长度、直径、重量的测定。之后对样品进行切片、烘干、制成粉末和过筛，备用。

1.3.2 水分、灰分、淀粉、蛋白质的测定

水分测定按照GB 5009.3—2016[19]《食品中水分的测定》中的第一法；灰分测定依据GB 5009.4—2016[20]《食品中灰分的测定》中的第一法；淀粉的含量按照GB 5009.9—2016[21]《食品中淀粉的测定》中的第一法进行测定；蛋白质的含量按照GB 5009.5—2016[22]《食品中蛋白质的测定》中的第一法测定。

1.3.3 天冬总多糖的测定[16]

绘制标准曲线：精密称取10 mgD-无水葡萄糖标准品，加水溶解，随后转移至25 mL容量瓶中定容，摇匀，即为对照品溶液。分别精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL无水葡萄糖标准溶液置于具塞试管中，加水至2 mL，缓慢滴加8 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，混匀，置沸水浴中水浴10 min，取出，置冰水浴中冷却10 min，空白对照为水。采用紫外-可见分光光度法在576 nm处测定溶液吸光度，以吸光度为纵坐标，无水葡萄糖质量为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，如图1所示。

图1 D-无水葡萄糖标准曲线

样品溶液制备：精密称取1 g天冬粗粉（过0.425 mm筛），置200 mL具塞锥形瓶中，加100 mL石油醚，回流提取至提取液无色，药渣挥干溶剂；再加入100 mL体积分数为80%的乙醇，水浴回流1 h，趁热过滤，将残渣及滤纸置锥形瓶中，加80 mL水，于100 ℃水浴回流1.5 h，趁热滤过，残渣及锥形瓶用热水10 mL洗涤1次，滤液加水定容至100 mL容量瓶中。精密量取0.5 mL待测样，加水至2 mL，按标准曲线绘制项中的方法显色和测定，以对照品计算各样品中天冬总多糖的含量。

1.3.4 天冬总皂苷的测定[16]

总皂苷标准曲线绘制：精密称取5 mg薯蓣皂苷元对照品，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀即得。分别精密吸取0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mL对照品溶液于具塞试管中，置水浴中挥干甲醇液体，之后分别加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，盖上试管塞混匀，在60 ℃水浴加热显色15 min，结束之后冷却5 min，再加入5 mL冰醋酸稀释，摇匀。空白对照为甲醇，用相同方式显色，采用紫外-可见分光光度法在456 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，薯蓣皂苷元质量为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，如图2所示。

图2 薯蓣皂苷元标准曲线

样品溶液制备：精密称取1 g天冬粗粉（过0.425 mm筛），置于100 mL的具塞锥形瓶中，精密吸取50 mL 48%乙醇，摇匀，超声61 min，过滤后取25 mL续滤液，沸水浴蒸干，加水转移至10 mL容量瓶中并定容，用水饱和正丁醇（每次约10 mL）萃取3次，萃取液合并后减压回收至干，残渣加甲醇转移至25 mL容量瓶中并定容，作为样品溶液。精密吸取一定量的样品溶液，按标准曲线绘制项下的方法显色和测定，以对照品计算各样品中天冬总皂苷的含量。

1.3.5 天冬游离氨基酸的测定[23]

采用HPLC-异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法测定，包括样品处理、柱前衍生、液相分析及含量计算四部分。

样品处理：参考刘梦迪[16]试验方法，并加以修改。精密称取1 g（精确至0.001 g）大天冬粗粉，置250 mL具塞锥形瓶中，加入80 mL水，在90 ℃水浴80 min，趁热滤过，残渣及锥形瓶用10 mL热水洗涤后，收集滤液，加水定容至100 mL，摇匀，即得样品溶液。

柱前衍生：衍生前先将样品溶液用水系滤膜过滤（去除水系杂质），之后将100 μL 0.1 mol/L异硫氰酸苯酯、100 μL 1 mol/L三乙胺与200 μL样品混合于离心管中，漩涡振荡均匀，室温黑暗条件下1 h，结束后，向上述反应体系中加入400 μL正己烷，漩涡振荡1 min，静置10 min，用移液枪吸取下层溶液，并用0.22 μm有机滤膜过滤，滤液进行HPLC分析。

HPLC分析：流动相A：10 mmol/L磷酸氢二钠，10 mmol/L硼酸钠，用盐酸调节pH至8.2；流动相B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）。采用岛津LC-15C，Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm），流速0.7 mL/min，室温，检测波长254 nm，进样量0.7 μL。

氨基酸含量计算：以0.1 mol/L盐酸稀释的氨基酸为标准品，制备一系列浓度的氨基酸标液（0.125，0.25，0.5，1和2 μmol/mL），得到各氨基酸峰面积相对于其浓度的标准曲线方程，以计算氨基酸含量。氨基酸混合标准品色谱图如图3所示。

图3 氨基酸混合标准品色谱图

1.4 数据处理

所有试验均设重复、平行各3次，所得数据采用Microsoft Excel 2016和 SPSS 27.0软件进行数据统计分析，采用Graphpad Prism 8进行标准曲线和氨基酸色谱图的绘制。根据计算得到的数据对两种天冬进行对比，并结合其他文献资料进行综合评价。

2 结果与分析

2.1 两种野生天冬形态特征比较

此试验样品是来自四川内江山区的两种野生鲜天冬，如图4所示。两种天冬均呈长纺锤形，其中大天冬（a）弯曲程度较为明显，而小天冬（b）略有弯曲。大天冬外皮多呈淡黄棕色，半透明；小天冬外皮颜色偏深，且表皮带有深浅不等的纵皱纹。大天冬质地稍软，而小天冬质地较为坚硬；两种天冬断面都有黏性，且中部有不透明的细心，呈黄白色，以上特点均符合天冬特征。如表1所示，大天冬长8~14 cm，直径约为2.2~3 cm，平均质量在60 g左右；小天冬长5~7 cm，直径约为1~2 cm，平均重量为10 g左右。综上可知，大天冬块长约为小天冬2倍，鲜体质量约为小天冬的6倍，表明大天冬个头更大。张先等[24]测定的贵州产地野生鲜天冬的鲜重为63.31 g，与此研究结果相近，但其直径比大天冬要小。

图4 大天冬（a）与小天冬（b）

表1 两种鲜天冬性状特征比较

2.2 两种野生天冬的基本成分和药理活性成分分析

两种野生天冬的基本成分含量如表2所示。两种天冬的水分含量均在70%以上，且小天冬的水分含量高于大天冬，二者具有一定的显著性差异（P＜ 0.05）。两种天冬的灰分含量为2.18~2.59 g/100 g，均低于熊大胜等[25]测定的广西、湖南、云南等产地天冬的灰分含量3.01~3.17 g/100 g。大天冬中的淀粉含量较高，为29.69 g/100 g，其含量约为小天冬3倍，说明两个品种的淀粉含量差异较大。大天冬、小天冬中的蛋白质含量不存在显著性差异。

据报道，天冬中主要含有多糖、皂苷和游离氨基酸等药理活性成分[26]，其中多糖有抗癌[27-28]、增强机体免疫活性[29]等功能。皂苷有抗肿瘤[30]、抗炎[31]、治疗便秘[32]等作用。氨基酸有镇咳平喘[33]、降血压和降血糖[34]等功效，因此分析两种野生天冬中的药理活性成分含量十分重要。如表2所示，大天冬的总多糖含量为16.17 g/100 g，总皂苷含量为3.63 g/100 g，游离氨基酸含量为1.98 g/100 g，其中多糖含量约为小天冬的2倍，皂苷含量高于小天冬，游离氨基酸低于小天冬，且均具有显著性差异（P＜0.05）。熊大胜等[25]测定了重庆、云南、广西和贵州等不同产地的天冬药材中总多糖、总皂苷及总氨基酸的含量，结果发现多糖含量在9.53~13.46 g/100 g，皂苷含量在1.56~1.77 g/100 g，总氨基酸含量在4.13~9.99 g/100 g范围内，经对比发现，此试验样品野生大天冬含有的多糖和皂苷要显著高于重庆、云南、广西和贵州等地的品种，但游离氨基酸含量要低于其测定的经酸水解后氨基酸的总含量。由此可见，野生大天冬具有更高的药用价值。

表2 两种天冬的营养成分分析

2.3 大天冬去皮前后药理活性成分分析

在药材炮制过程中，天冬要先进行去皮处理，但去皮可能会导致活性成分的损失[14]。因此，试验对去皮前、后大天冬中的总多糖、总皂苷的含量及游离氨基酸种类和含量进行了分析。如表3所示，去皮之后大天冬中总多糖、总皂苷及游离氨基酸的含量均出现不同程度的显著下降，其中总多糖含量下降近22%，总皂苷降低约32.5%，游离氨基酸总量下降约15.6%，且去皮前后的总多糖和总皂苷含量之间存在显著性差异（P＜0.05）。李敏等[14]对产自四川内江种植区天冬药材的表皮进行了多糖和皂苷的成分测定，发现一年半生天冬药材的表皮中皂苷含量约为天冬药材的2倍，同时也含有较高的多糖，这表明天冬皮含有较多的活性成分，与此试验的结果具有一致性。

表3 大天冬去皮前后活性成分比较 单位：g/100 g

目前，研究者还尚未探究去皮对天冬中游离氨基酸组成的影响。因此，研究还测定了去皮前、后大天冬中游离氨基酸的种类和含量。如表4所示，去皮前后大天冬所含游离氨基酸种类是一致的，且大多数氨基酸的含量均出现了不同程度的下降。但去皮前，大天冬中甘氨酸最多，占总氨基酸的24.7%；甲硫氨酸最少，占总氨基酸的0.9%。去皮之后，苏氨酸最多，占比25.5%；缬氨酸最少，占比0.7%，这表明去皮导致主要氨基酸的含量发生了变化。综上可知，天冬表皮中也含有较多的多糖、皂苷和游离氨基酸，因此去皮之后会导致这些活性成分的损失，降低其药用活性。

表4 大天冬去皮前后游离氨基酸种类 单位：mg/g

3 结论

此试验对四川省内江市山区发现的两种野生天冬进行了活性成分的检测和品质分析。其中野生大天冬长约8~14 cm，直径约为2.2~3 cm，平均质量为60 g。多糖、皂苷和游离氨基酸等药理活性成分含量显著高于小天冬，且优于其他产地天冬药材的相关测定结果。野生大天冬在大小形态和药理活性成分含量等方面均优于其他产地的现有天冬，因此适合进行大规模的人工栽培。此外，此研究还表明去皮会导致天冬总多糖、总皂苷及游离氨基酸等药理活性成分的损失，因此，在天冬炮制过程中可以考虑省略“去皮”这一步骤，从而最大程度地保留天冬的药理活性成分，同时也可减少人工成本和药材资源的浪费。