动物源性成分分子生物学检测技术研究进展

陈基耘

广东省珠海市质量计量监督检测所（珠海 519002）

近年来，食品安全问题日益突出，不法分子利用廉价肉掺入高价肉中，从而获取巨额利润。在我国，肉羊是畜牧业的重要支柱产业之一，消费需求旺盛。然而，用鸡、鸭和猪肉掺入或者替代羊肉的事件屡见不鲜。这些事件的出现严重干扰了我国畜肉产业，损害了消费者的权益，制约了肉品质量的提升甚至产生了宗教信仰相关的问题。随着不法商贩的造假手段日益翻新，肉制品质量安全的复杂性也逐渐增加，因此，传统的鉴别技术已经不能满足市场监管的需求。准确、高效、快速的多种动物源性成分检测技术的开发，不仅能使消费者的权益得到保障，也是监管部门工作的技术支持。目前，国内外已经研究出多种检测方法，常见的肉制品鉴别方法包括形态学、代谢组学、光谱学和基因组学方法等。形态学主要依赖光学显微镜技术和数据图像分析像结合进行鉴定；光谱学尽管分析速度较快，但是通常需要对大量样品进行建模，而且通用性不强；蛋白质组学鉴定技术包括电泳、化学技术和免疫学方法等。由于蛋白质结构容易受温度、微生物污染、抗原交叉、反应剪切力等多种因素影响，对仪器、试剂和样品处理要求高，存在复杂、昂贵、费时且缺乏特异性等问题，因此，蛋白质鉴定技术的可靠性和稳定性较差，并不能很好地满足掺假肉检测的需求。近年来，以核酸分子鉴定技术为主的生物学鉴定方法由于其灵敏度高、特异性强和准确度高等优点，已成为国际上肉类源性成分鉴别的主流技术。核酸分子鉴定能够克服蛋白鉴定方法的不足，具有基质干扰小、易于操作和保存、鉴定成本相对较低等优点，适宜在检测机构实验室中应用与推广。因此，基于上述技术优势，文章对肉与肉制品中多种动物源性成分鉴定相关技术进行介绍并进行展望，以期为监管机构、检测机构的肉与肉制品安全监督提供技术参考。

1 PCR技术

PCR技术又称为聚合酶链技术（PCR），目前，国内外进行多种动物源性成分鉴定的常用PCR技术包括多重PCR[1-3]、实时荧光定量PCR[4-6]、限制性片段长度多态性PCR[7-9]等。这些技术主要是通过在常规PCR技术基础上加入荧光染料或标记探针，根据荧光信号的累积对反应过程进行实时监控，以实现对起始模板的精确定量和定性分析。自2007年以来，我国也陆续颁布了一系列以PCR技术为主的国家标准[10-13]，以满足动物源性成分鉴定的检测和监管需求。但是这些标准大多只用于定性鉴定，未进行定量分析。

多重PCR技术，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。如Iwobi等[14]选择β-肌动蛋白基因和肌肉生长抑制素基因为分析对象，设计引物和Taqman探针，采用三重PCR用于定性和定量检测混合肉中牛源性和猪源性成分。多重PCR技术因其灵敏度高、检测效率高的特点，目前已被广泛应用于多种动物源性成分的同时鉴定，但该技术因在同一反应中投入了多对引物，易引起交叉反应。

荧光定量PCR技术，荧光试剂的使用包括荧光探针或者荧光染料。因所使用荧光试剂的不同，可分为特异类和非特异类两类。特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物。而非特异性检测方法是在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。这些技术亦被广泛应用于肉类掺假的鉴定，Kang等[15]采用Subr Green染料，在100%~0.01%范围内对猪肉和牛肉混合样品中猪肉的含量进行测定，用于检测牛肉加工制品中是否有猪肉掺假。

限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCRRFLP）技术，是用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性。如Uddin等[16]建立了牛、水牛、鸡、鸭、山羊、绵羊和猪的七重PCR-RFLP检测方法，用于生鲜肉及加工肉制品中目标物种的鉴别。然而，该技术使用内切酶，这无形中增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。

数字PCR是近年来发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。20世纪末，Vogelstein等[17]提出数字PCR的概念，通过将一个样本稀释并分成几百到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含最多一个拷贝的DNA模板，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增后对各个反应单元的荧光信号进行统计分析。如Ren等[18]采用微滴数字PCR定量测定绵羊和山羊肉产品中鸡肉的含量，并在检验过程中将动物源成分质量比例转换为拷贝数的比例，结果表现出良好的重复性和稳定性。与传统的PCR、荧光定量PCR相比，数字PCR在定量上不依赖扩增阈值（Ct值），表现出更高的准确度和灵敏度，但是该技术通常使用芯片完成，检测成本偏高，试验对操作人员及设备环境的要求较高，因此难以在基层检测机构中普及。

2 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（LAMP）是Notomi等[19]早在2000年建立的一种新型的等温扩增方法。与传统的聚合酶链式反应（PCR）相比，LAMP技术可以在恒温状态下完成反应而不需要在精密的控温设备中对目标模板进行反复的热变性，通常在0.5~1 h内就可以实现目标序列进行109倍的连续快速扩增。伴随着DNA片段混合物的生成，大量的白色焦磷酸镁沉淀生成，通过用SYBR green对DNA片段产物进行荧光染色或者对焦磷酸镁生成后溶液的浊度进行分析，即可用肉眼或者仪器判断样本中是否含有目标链。基于上述LAMP检测技术原理的特殊性，该技术摆脱了复杂的精密仪器的限制，能满足现场检测及执法的需求，结果肉眼可判别，因此被应用于肉类快速检测中。如Cai等[20]研发了一种可在20 min内检测出肉制品中猪源成分的实时环介导等温扩增的测定法，这也是首次应用LAMP法检测商业产品中的猪源成分。Zahradnik等[21]采用LAMP法检测加工食品中马肉含量，能从制备的香肠中检测到0.1%的马肉。

3 DNA分子杂交技术

DNA分子杂交的基础是具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等形成稳定的双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子分离成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。这种技术很早就被应用于肉类检测中，如Buntjer等[22]建立了牛、羊、马、鸡、猪等多种物种的分子杂交检验方法，在混合肉中可以检测到最低1%的目标肉，并且对于热加工的样品依然具有很好的检测效果。然而，该技术DNA杂交技术作为一种基础的检测技术，也存在灵敏度低、耗时长等缺陷。

4 DNA条形码技术

DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。在发现一种未知物种或者物种的一部分时，研究人员便描绘其组织的DNA条形码，而后与国际数据库内的其他条形码进行比对。如果与其中一个相匹配，研究人员便可确认这种物种的身份。现今大部分动物采用COI基因作为条形码标准片段[23]。目前，基于DNA条形码技术的研究主要集中在水产品鉴别领域，如：李新光等[24]利用DNA条形码技术对15种烤鱼片进行鉴定，结果发现仅有一种烤鱼片与标识相符，存在大量的造假行为；Cardeñosa等[25]在广州的市场上采购了200种鲨鱼鱼鳍，这些鱼鳍中只有0.5%含有完整的COI序列。

5 展望

随着人民生活水平的提高，群众对生活品质特别是食品安全的关注一直是近年来的热点。快速、准确地检测肉类源性成分，是我们迫切需要解决的问题。基于分子生物学原理的检测技术，因其低廉、高效、灵敏的优势，已成为目前国内外相关领域检测的主流技术。但是，目前的检测技术在精准定量方面，效果仍不尽人意，难以解决有意掺假和无意掺假等执法监管难题。为此，针对以上窘况，开展针对性的研究，才能为科学执法提供更准确可靠的技术支持。

6 结语

综上所述，以分子生物学为基础的检测技术种类丰富，其灵敏度高、特异性强及操作简单的特点，自问世以来倍受青睐，在检测领域拥有很高的应用价值。但基于分子生物学的检测技术应用于肉类掺假检测领域仍存在一些挑战。比如，荧光染料与DNA双链的非特异性结合或者体系中存在与靶基因同源的序列都可能会影响结果的准确性。随着分子生物学检测技术的飞速发展，新型荧光标记物的设计及新型检测模式的深入探索，在肉类掺假检测领域，快速准确、低成本、高通量的检测技术将指日可待。