采收方式对调制后烟叶叶片和主脉TSNAs 及前体物含量的影响

张晶云，荣仕宾，2，秦艳青，吴 疆，王 俊，李晶晶，冯雨晴，赵园园，钟 秋，史宏志

（1.河南农业大学 烟草学院/烟草农业减害研究中心，河南 郑州 450002；2.河南省烟草公司许昌市公司襄城县分公司，河南 襄城 461700；3.中国烟草总公司四川省公司，四川 成都 600041；4.河南省南阳市烟草专卖局，河南南阳 473000；5.四川省烟草公司德阳市公司，四川 德阳 618400）

烟草特有亚硝胺（TSNAs）是由烟草生物碱和亚硝酸发生亚硝化反应生成的存在于烟叶和烟气中的具有动物致癌性的N-亚硝基化合物[1]。随着吸烟损害健康的问题越来越受到人们的重视，降低TSNAs相关研究得到世界的广泛关注。TSNAs主要有8 种[2-3]，其中以N-亚硝基去甲基烟碱（NNN）、4-（N-甲基-亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）和N-亚硝基假木贼碱（NAB）4 种含量较高。TSNAs 前体物主要包括生物碱、硝酸盐和亚硝酸盐，生物碱主要有4种：烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱，其中烟碱占生物碱总量的92%以上，属于叔胺类生物碱，其吡咯环被氧化后生成假氧化烟碱（PON），进而生成NNK，降烟碱、新烟草碱和假木贼碱等仲胺类烟碱可直接生成NNN、NAT 和NAB[4-5]。关于硝酸盐和亚硝酸盐与TSNAs 的 关 系 讨 论 众 多，BRUNNEMANN 等[6]和FISCHER 等[7-8]认为总TSNAs 与硝酸盐之间存在显著正相关关系，硝酸盐水平是TSNAs 积累的一个指示物，硝酸盐还原成亚硝酸盐的过程则是TSNAs 积累的限制阶段。BURTON 等[9]研究表明，TSNAs 在烟叶中的分布更类似于亚硝酸盐的分布，引起TSNAs积累的主要因素是亚硝酸盐。史宏志等[10]认为TSNAs 的形成受到生物碱和亚硝酸盐的双重影响。TSNAs 的形成和积累主要发生在调制过程和贮藏过程中，在调制阶段，由于微生物的作用，硝酸盐被硝酸还原酶还原生成亚硝酸盐，进而与生物碱发生反应形成TSNAs[11-12]。此后的研究表明[13-16]，调制结束后的贮藏阶段也会形成大量的TSNAs，在贮藏过程中，硝酸盐可产生气态氮氧化物，其与生物碱发生亚硝化反应生成TSNAs。

烟梗是烟叶的重要组成部分，是卷烟生产中的原料之一。烤烟的含梗率为25%～35%。烟梗具有填充值高、焦油释放量低的优点，是卷烟降焦和降低配方成本的重要手段[17-19]。烟叶叶片和主脉中TSNAs 前体物含量有较大差异，靳彤等[20]、刘扣珠等[21]对初烤烟叶片和主脉间TSNAs及前体物进行差异分析，结果表明，主脉中生物碱含量低于叶片，但硝态氮含量和TSNAs 含量显著高于叶片。不同采收方式对叶片和主脉间TSNAs 含量有重要影响，采收方式不同，叶片和主脉的失水速率有所差异，杨焕文等[22]对白肋烟叶片和主脉中TSNAs进行了相关研究，但是由于不同类型烟叶所采用的调制方法不同，因而调制后烟叶中TSNAs 含量也有所差异。多年来，有关采收方式的研究多集中在对烟叶产质量的影响方面[23-24]，对TSNAs 的影响研究较少，为探究采收方式对不同类型烟叶叶片和主脉间TSNAs 及前体物的影响差异，以烤烟品种云烟87、晒烟什烟1号和雪茄烟德雪3 号为材料，设置摘叶采收、片脉分离采收和带茎采收3 种采收方式，探究其对叶片和主脉中TSNAs 及前体物含量的影响，为选择适宜的采收方式，有效降低烟叶叶片和主脉中TSNAs 及前体物含量，实现优质低害烟叶生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 选材与地点

烤烟品种试验地点设在河南省南阳市方城县清河镇金叶园园区。供试材料为当地主栽品种云烟87 的上部6 片叶。云烟种植面积为666.67 m2，烟苗于2020 年4 月15 日移栽，行株距为120 cm×55 cm。试验于8月19日开始采收，8月20日开始烘烤，于8 月27 日烘烤结束。施肥方式为当地习惯施肥，每公顷45 kg 氮，供试肥料包括烟草专用复合肥（N∶P∶K=10∶10∶20）、硝酸钾、硫酸钾、液态钾肥、芝麻饼肥、沼渣有机肥。田间管理按照当地优质烟叶生产技术规范进行。

雪茄烟和晒烟试验地点设在四川省什邡市师古镇。供试材料为当地主栽品种雪茄烟德雪3号和晒烟什烟1 号的上部烟叶，各供试品种种植面积均为333.33 m2。烟苗于2020 年4 月30 日移栽，行距120 cm，株距40 cm。供试土壤属紫色土，土壤肥力中等，前作为水稻，田间管理按照当地优质烟叶生产技术规范统一管理。

1.2 试验设计

采取随机区组试验设计，对采收方式设置3 个处理：摘叶采收（T1），即上部6片叶成熟后一次性采收进行调制；片脉分离采收（T2），即上部6片叶成熟后一次性采收，将叶片和主脉分开进行调制；带茎采收（T3），即上部6 片叶成熟后带茎一次性砍收进行调制。

烤烟上部叶（顶部3 片叶）正常成熟时对上部6片叶全部进行采摘烘烤，T2、T1、T3 处理烘烤周期为5、6、7 d；雪茄烟采收后在钢结构现代化晾房调制，T2-T1-T3 处理周期为22、25、30 d；晒烟在自然环境下，白天阳光下直晒与夜晚晒棚内挂晾反复交替进行，T2、T1、T3处理时间周期为15、19、25 d。具体工艺流程和技术操作分别按烤烟烘烤技术规程[25]和什邡当地优质雪茄烟叶生产技术规范进行统一管理，调制结束后，将烟叶叶片和主脉分开，磨碎，过孔径0.25 mm筛子，待测。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 烟叶和主脉硝酸盐和亚硝酸盐含量 烟叶硝酸盐含量采用浓H2SO4-水杨酸法测定[26]，烟叶亚硝酸盐含量采用对氨基苯磺酸法测定[27]。

1.3.2 烟叶和主脉生物碱含量 准确称取200 mg烟末置于15 mL 试管中，加入内标溶液100 μL、10% NaOH 溶液1.5 mL 及甲基叔丁基醚（MTBE）3 mL，旋紧旋盖，充分振荡5 min 后，室温放置过夜（24 h±2 h），取上层清液进行GC（气相色谱法）分析。每个样品应平行测定2次。其原理是在碱性条件下，利用甲基叔丁基醚等有机溶剂提取烟草或烟草制品中的生物碱类物质，通过气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）定量分析检测其中4 种生物碱含量。

1.3.3 烟叶和主脉TSNAs 含量 样品均由上海烟草集团北京卷烟厂进行测定。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用法（SPE-LC-MS/MS）[SPELC：Spark Holland，Symbiosis（Pico）；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500]。称取1.0 g 烟样，将其放入50 mL 锥形瓶中，加入40 μL 4 种氘代TSNAs（内标）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸铵水溶液，在室温下用振荡器（200 r/min）萃取60 min，萃取液过0.45 μm 水相滤膜后使用LC-MS/MS 检测TSNAs 含量。NNN、NNK、NAT 和NAB 含量之和即为TSNAs总量。

1.4 数据处理

采用Excel 2019 软件制表绘图，采用DPS 7.05数据处理系统的单因素试验统计分析进行方差分析，显著性检验用F检验法，多重比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 不同采收方式对调制后烟叶叶片和主脉硝酸盐含量的影响

如图1所示，从烤烟结果可以看出，烤烟叶片中硝酸盐含量以片脉分离采收最低，较摘叶采收降低35.29%，带茎采收处理最高；主脉中硝酸盐含量以摘叶采收处理最低，带茎采收处理最高。从晒烟和雪茄烟结果可以看出，叶片和主脉硝酸盐含量均高于烤烟，且二者叶片中硝酸盐含量均以片脉分离采收最低，分别比摘叶采收低24.53%和34.25%；二者主脉中硝酸盐含量均表现为摘叶采收＜片脉分离采收＜带茎采收。

图1 不同采收方式调制后烟叶硝酸盐含量比较Fig.1 Comparison of nitrate content of tobacco leaves after modulation by different harvesting methods

2.2 不同采收方式对调制后烟叶叶片和主脉亚硝酸盐含量的影响

如图2所示，由烤烟结果可以看出，烤烟叶片中亚硝酸盐含量以带茎采收最高，其他2 个处理无显著差异；烤烟主脉中亚硝酸盐含量以片脉分离采收处理最低，较摘叶采收降低14.34%。由晒烟和雪茄烟结果可以看出，二者叶片和主脉中亚硝酸盐含量均高于烤烟，且二者叶片中亚硝酸盐含量均以片脉分离采收处理最低，分别比摘叶采收降低29.35%和40.44%；二者主脉中亚硝酸盐含量均以摘叶采收处理最低，其他2个处理无显著差异。

图2 不同采收方式调制后烟叶亚硝酸盐含量比较Fig.2 Comparison of nitrite content of tobacco leaves after modulation by different harvesting methods

2.3 不同采收方式对调制后烟叶叶片和主脉生物碱含量的影响

从表1 可以看出，3 个类型之间叶片烟碱含量差异不大，但是晒烟和雪茄烟叶片生物碱总量略高于烤烟，主要是晒烟和雪茄烟叶片的降烟碱含量高于烤烟。烤烟叶片生物碱总量以带茎采收处理最高，比摘叶采收增加3.49%；晒烟和雪茄烟叶片生物碱总量以片脉分离采收处理最低，分别比摘叶采收低18.48%和12.12%，以带茎采收处理最高。

表1 不同采收方式调制后烟叶叶片生物碱含量比较Tab.1 Comparison of alkaloid content of lamina after modulation by different harvesting methods %

由表2 可知，3 种类型烟叶主脉中生物碱含量差异不大。烤烟主脉中生物碱总量以片脉分离采收处理最高，比摘叶采收增加26.25%，另外2 个处理无显著差异；晒烟和雪茄烟主脉中生物碱总量以片脉分离采收处理最高，分别比摘叶采收增加69.62%和79.10%，以摘叶采收处理最低。

表2 不同采收方式调制后烟叶主脉生物碱含量比较Tab.2 Comparison of alkaloid content of stem after modulation by different harvesting methods %

2.4 不同采收方式对调制后烟叶叶片和主脉TSNAs含量的影响

从表3 可以看出，晒烟和雪茄烟叶片TSNAs 含量高于烤烟；烤烟、晒烟和雪茄烟3种类型烟叶叶片TSNAs 含量均以片脉分离采收处理最低，TSNAs 总量分别比摘叶采收降低26.65%、60.53%和48.48%，三者叶片TSNAs 总量均以带茎采收处理最高，分别比摘叶采收增加7.87%、40.23%和72.12%。

表3 不同采收方式调制后烟叶叶片TSNAs含量比较Tab.3 Comparison of contents of TSNAs in lamina after modulation by different harvesting methods ng/g

从表4 可以看出，晒烟和雪茄烟主脉TSNAs 总量高于烤烟；烤烟主脉TSNAs 含量以片脉分离采收处理最低，带茎采收处理最高，片脉分离采收处理的烤烟主脉TSNAs 含量比摘叶采收处理降低42.08%，而晒烟和雪茄烟主脉TSNAs 含量均以摘叶采收处理最低，带茎采收处理最高，二者分别比摘叶采收增加25.59%和29.80%。

表4 不同采收方式调制后烟叶主脉TSNAs含量比较Tab.4 Comparison of contents of TSNAs in stem after modulation by different harvesting methods ng/g

3 结论与讨论

生物碱、硝酸盐、亚硝酸盐皆是TSNAs 的前体物质，不同类型烟叶TSNAs 及前体物含量有所差异。众多研究表明[28-29]，雪茄烟中的TSNAs 及前体物硝酸盐、亚硝酸盐、生物碱含量均高于烤烟，这与本试验研究结果相一致。不同类型烟叶叶片和主脉中TSNAs 含量测定结果表明，烤烟叶片TSNAs 含量高于主脉，而晒烟和雪茄烟叶片TSNAs 含量低于主脉，推测出现这一结果可能与不同类型烟叶所采用的调制方式有关，烤烟在烘烤过程中，相对较高温度下微生物活性弱，变黄时间短，烟叶失水相对较快，不利于硝酸盐还原为亚硝酸盐，主要是生物碱发挥作用发生亚硝化反应生成TSNAs，而叶片生物碱含量高于主脉，因此烤烟叶片中TSNAs 含量高于主脉；晒烟和雪茄烟采用晒制和晾制方式进行调制，相对低温条件有利于微生物活动，变黄时间长，叶片失水速度相对较慢，在微生物作用下，硝酸盐还原为亚硝酸盐，进而促进TSNAs 的生成，加上晒烟和雪茄烟主脉中硝酸盐和亚硝酸盐含量均高于叶片，因此二者主脉中TSNAs含量高于叶片。

不同采收方式调制后烟叶叶片和主脉TSNAs含量有显著差异，烤烟叶片和主脉中TSNAs 总量表现为带茎采收＞摘叶采收＞片脉分离采收，猜测这与烟草中水分有关，调制过程中烟叶水分变化与细胞膜透性及细胞内物质外渗密切相关[30]，在烘烤过程中，带茎采收的烟株茎秆里的水分向叶片和主脉不断运输，烘烤时间延长，烟叶干燥速度慢，且茎秆中生物碱向主脉中转运，继而向叶片中转运，因此叶片生物碱含量以带茎采收处理最高，促进了TSNAs的形成和积累。同理，片脉分离采收的烟叶干燥最快，烘烤及变黄时间最短，各前体物质来不及转化或转化较少，叶片和主脉中TSNAs 形成较少。晒烟和雪茄烟叶片TSNAs 含量在采收方式间表现为片脉分离采收＜摘叶采收＜带茎采收，这与杨焕文等[22]研究结果相一致，这可能是因为二者在调制过程中，带茎采收处理的烟株调制时间更长，促进大量TSNAs 的形成和积累，而片脉分离采收的叶片失水较快，变黄时间相对较短，TSNAs 的形成相对较少；主脉中TSNAs 含量在采收方式间表现为摘叶采收＜片脉分离采收＜带茎采收，这可能是由于茎秆中硝酸盐含量高于叶片和主脉，茎秆中的硝酸盐随着水分迁移向主脉运输，因此主脉中TSNAs 含量以带茎采收处理最高，而片脉分离采收处理的主脉中硝酸盐无法向叶片运输，摘叶采收处理主脉中硝酸盐可向叶片转运，加上主脉中硝酸盐含量高于叶片，因此片脉分离采收主脉中TSNAs 含量高于摘叶采收。采用不同采收方式进行研究有利于揭示烟叶TSNAs 的形成机制，但在实际应用中，采收方式的确定还要综合考虑其对烟叶质量的影响。

近年来关于带茎采收对烤烟产质量的影响研究较多，前人认为[31-34]，带茎烘烤可以降低烟叶酶促褐变反应，改善上部烟叶烤后品质，提高经济效益等。本试验中，相比于摘叶采收，虽然带茎采收增加了烤烟TSNAs 含量，但增加比例小，为7.87%，远低于晒烟和雪茄烟TSNAs 的增加比例，晒烟和雪茄烟增加比例分别为40.23%和72.12%，推测是因为晒烟和雪茄烟的调制时间较烤烟长，带茎采收后调制时间延长更久，硝酸盐向亚硝酸盐的转化更加充分，因此晒烟和雪茄烟带茎采收后TSNAs 含量增加较多。对于烤烟而言，带茎烘烤处理的茎秆里储存的水分具有缓冲作用，使烘烤时间相应延长，TSNAs含量比摘叶采收处理稍有增加，但有利于大分子物质的充分转化和香气物质的形成[35]。片脉分离采收处理虽然可降低烤烟叶片TSNAs 及前体物含量，但是由于烘烤过程中叶片与主脉分离，主脉中的水分不能向叶片迁移，会因叶片失水过快[36]，导致内含物质转化不充分，香气质差，香气量少，刺激性和杂气增加，烟叶品质急剧下降[37]。因此，在实际生产中选择采收方式应综合权衡其对烟叶质量和安全性的影响。