不同烘烤工艺对烟草CB-1 上部叶抗性淀粉含量的影响

王 佩，王 涛，宋江雨，丁应福，王廷贤，杨占伟，宋朝鹏，李静超

（1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；2.云南省烟草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3.福建省烟草公司南平市公司，福建 南平 353000）

烤烟上部烟叶占整株烟叶的30%～45%[1]，因其香气浓度厚实且饱满，有利于增加吃味浓度，在卷烟叶组配方中起主导作用[2]。但由于上部叶光照充足，烤后烟叶身份偏厚，淀粉、蛋白质等大分子有机物含量高，在烘烤过程中容易烤青和挂灰，导致烟叶上部叶工业可用性偏低[3]。纪成灿等[4]研究表明，造成翠碧一号（CB-1）上部烟叶烤后光滑的根本原因是淀粉分解不彻底。杨胜男等[5]研究发现，淀粉水解及酶解的程度与直链淀粉含量呈反比。研究玉米[6]、小麦[7]等作物抗性淀粉形成原因发现，直链淀粉经过湿热处理后会回生老化，形成难以被淀粉酶水解的抗性淀粉。直链淀粉含量高低直接影响抗性淀粉含量[8]。烟叶生长发育过程中，抗性淀粉含量与直链淀粉含量存在显著正相关关系[9]。徐梦晓等[10]研究表明，随着烟叶的不断成熟，抗性淀粉含量逐渐降低，直链淀粉和支链淀粉含量随烟叶衰老呈下降趋势；段史江等[9]研究表明，在烘烤过程中，变黄期是烟叶中抗性淀粉降解的主要时期。目前，通过调整烘烤工艺措施降低烤后烟叶淀粉含量取得了显著进展[11-13]。其中，闫鼎等[12]认为，中温中湿烘烤工艺能显著降低烟叶淀粉含量；危阜斌等[13]研究发现，低温慢变黄可使淀粉充分降解。

以往研究主要集中于烟叶烘烤过程中总淀粉含量的变化，关于不同烘烤工艺条件下烟叶抗性淀粉含量的变化尚未见报道。为此，以烤烟CB-1 上部叶为研究对象，通过对CB-1 烤后烟喷洒α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶混合溶液，探究烤后烟中是否存在抗性淀粉，以当地常规烘烤工艺为对照，探究主变黄温度对抗性淀粉含量的影响，旨在通过调整烘烤工艺降低烘烤过程中烟叶抗性淀粉含量，从而改善烟叶品质，提高上部叶可用性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2020—2021 年度在福建省南平市将口镇松柏村进行，以烤烟品种CB-1 为试验材料，田间移栽、施肥和其他田间管理措施均按照当地优质烟叶生产技术规范进行。采摘成熟度、部位一致的上部叶，采收烟叶当天烘烤。烘烤过程中，每12 h取样1 次，除去叶脉，将样品立即冷冻于液氮中，-80 ℃保存，用于淀粉组分、淀粉酶以及抗性淀粉等含量的测定。

1.2 试验设计

1.2.1 烤后烟叶喷洒淀粉酶处理 参考刘勇等[14]的喷洒方法。取CB-1 上部叶的烤后烟叶，在烤后烟叶上喷洒α-胰淀粉酶（10 g/L）和淀粉葡糖苷酶（AMG，0.3 g/L）的混合溶液，置于常温下（25 ℃）保存，于喷洒溶液后的0、12、24、36、48、60 h 分别对烟叶进行取样，每次随机选取3片烟叶，测定淀粉含量（质量分数）。所有样品均设置3次重复。

1.2.2 设置不同主变黄温度的烘烤工艺 参考任杰等[15]、魏硕等[16]的方法，在烟叶变黄期分别设置不同的温度，烟叶烘烤共设置4个处理。

现行烘烤工艺（对照组，CK）：以福建当地烘烤工艺处理，烟叶主变黄温度集中在38～41 ℃。

低温变黄工艺（T1）：将主变黄温度设置为36 ℃，其他按当地烘烤工艺进行。

中温变黄工艺（T2）：将主变黄温度设置为38 ℃，其他按当地烘烤工艺进行。

高温变黄工艺（T3）：将主变黄温度设置为40 ℃，其他按当地烘烤工艺进行。

4 种烘烤工艺设置温湿度的变化曲线如图1所示。

图1 4种烘烤工艺设置温度的变化曲线Fig.1 The temperature change curves of the four curing processes

1.3 测定指标及方法

1.3.1 超微结构分析测定 参考杨胜男等[5]的方法，在叶片右侧的第五和第六支脉之间，距离主脉3～5 cm 处切取0.5 cm×0.5 cm 叶肉组织，采用2.5%戊二醛溶液（pH 值7.2～7.4，0.1 mol/L PBS 缓冲液配制）进行固定，室温放置30 min 后，于4 ℃冰箱内保存。采用透射电镜观察叶绿体超微结构。

1.3.2 直链淀粉、支链淀粉和总淀粉的含量测定

采用双波比色法测定直链淀粉和支链淀粉含量[17]。参考吴飞跃等[18]的方法测定淀粉含量，使用分光光度计在640 nm 下测定吸光度。其中每份样品重复测定3次，其平均值即为该样品的值。

1.3.3 抗性淀粉的含量测定 准确称取0.15 g冷冻干燥的烟叶样品于研钵中研碎，加入4 mL α-胰淀粉酶，充分匀浆后转移到EP管中，按照Megazyme公司的K-RSTAR试剂盒说明书进行测定。

1.3.4 淀粉酶活性测定 采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定淀粉酶活性[19]。酶活性单位定义：在37 ℃、pH 值5.6 的条件下，以1 mg 酶蛋白在10 min内分解可溶性淀粉产生1 mg麦芽糖为1个酶活性单位（U）。

1.4 数据处理

利用SPSS 23.0软件进行数据方差分析（单因素ANOVA）及相关分析（Pearson 相关系数），采用LSD法进行数据间的差异显著性检验；利用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 烘烤过程中烟叶淀粉降解情况分析

利用透射电镜观察烟叶烘烤过程中叶绿体内的淀粉粒变化情况（图2A）。结果显示，随烘烤的不断进行，紧贴细胞壁的叶绿体不断降解，定色期基本降解完全。成熟鲜烟中叶绿体内的淀粉粒数量多且体积大，随叶绿体紧贴细胞壁。烟叶烘烤至变黄期，淀粉粒开始大量降解，此时淀粉粒游离至细胞中部，无序散落在细胞内；进入烟叶定色期，细胞内所含淀粉粒数量极少，叶绿体已经解体，此时大部分淀粉粒已降解完全；烟叶烘烤至干筋期，此时细胞内已无法观察出清晰的细胞器，嗜锇颗粒含量相对较多，嗜饿颗粒与极少的淀粉粒无序散落在细胞中，细胞扭曲破裂严重。

烘烤过程中，淀粉含量和淀粉酶活性测定结果（图2B）显示，烘烤前期，淀粉含量与淀粉酶活性呈反比。烘烤24～72 h，淀粉酶活性较高，此时淀粉大量降解，烘烤72 h 后，淀粉酶活性持续降低，淀粉缓慢降解，进入平台期。综上所述，烟叶在烘烤过程中，变黄期烟叶淀粉降解量最高；进入定色期后，淀粉酶活性迅速下降，淀粉降解速度快速下降，淀粉含量缓慢下降；干筋期后，淀粉含量无明显变化。

2.2 淀粉酶处理后烟叶淀粉含量变化

如图3A 所示，喷洒淀粉酶溶液后，烤后烟叶淀粉含量为6.19%～6.84%，喷洒淀粉酶溶液对烤后烟叶中淀粉含量无显著影响（P＞0.05）。喷洒淀粉酶溶液后，烟叶存放时间长短与淀粉含量无显著关系（P＞0.05）。常温下，淀粉酶溶液对烤后烟叶中的淀粉不具有酶解作用，说明烟叶淀粉中可能存在不能被淀粉酶酶解的组分（抗性淀粉）。图3B 为抗性淀粉的显色反应，颜色越深，表明抗性淀粉含量越高。综上，烤后烟叶中存在抗性淀粉，常温下不易酶解。

图3 喷洒淀粉酶溶液后烟叶淀粉含量（A）及显色（B）Fig.3 Starch content（A）and visual detection（B）of tobacco leaves after spraying with amylase solution

2.3 不同烘烤工艺对烤后烟叶淀粉组分以及抗性淀粉含量的影响

2.3.1 不同烘烤工艺对烤后烟叶直链淀粉与支链淀粉含量的影响 测定不同烘烤工艺烘烤过程中烟叶直链淀粉与支链淀粉的含量发现，随着烘烤时间的推进，直链淀粉与支链淀粉含量均在变黄前中期迅速下降，而后缓慢下降（图4）。随着主变黄温度的升高，直链淀粉与支链淀粉的降解量增加。烘烤0～48 h，CK、T1、T2、T3 处理烟叶的直链淀粉降解量分别为58.03%、22.92%、48.81%、51.40%，烟叶支链淀粉降解量分别为58.74%、34.23%、50.13%、53.56%。烘烤24 h后，T1处理烟叶中直链淀粉与支链淀粉开始快速降解。烘烤48 h 后，CK、T2、T3 处理烟叶直链淀粉、支链淀粉含量显著低于T1 处理，随后各处理烟叶直链淀粉和支链淀粉含量大幅度降低。烘烤120 h 后，各处理烟叶中的直链淀粉与支链淀粉含量逐渐趋于稳定。CK、T1、T2、T3 处理烤后烟叶中直链淀粉含量分别为2.21%、2.59%、0.83%、1.98%，支链淀粉含量分别为3.64%、6.21%、3.10%、4.54%。综上，变黄前中期，烟叶直链淀粉和支链淀粉降解量大，降解速度快；直链淀粉降解量T2＞T3＞CK＞T1，支 链 淀 粉 降 解 量T2＞CK＞T3＞T1，CK、T3 处理烤后烟叶中的直链淀粉与支链淀粉含量无显著差异。T2 处理的烤后烟叶中直链淀粉与支链淀粉含量最低。

图4 不同烘烤工艺条件下烟叶直链淀粉含量（A）和支链淀粉含量（B）Fig.4 Amylose content（A）and amylopectin content（B）of tobacco leaves under different curing conditions

2.3.2 不同烘烤工艺对烤后烟叶抗性淀粉含量的影响 研究不同烘烤工艺对抗性淀粉含量的影响，结果显示，在4种烘烤工艺条件下，烟叶中抗性淀粉的降解规律总体上均呈现出先快速降解、再缓慢降解、最后趋于稳定的变化趋势，但不同烘烤工艺的抗性淀粉含量变化又具有各自的特征（图5）。CK、T1、T2 和T3 处理的烤后烟叶中抗性淀粉含量分别为2.48%、3.25%、1.84%、2.61%。抗性淀粉含量在变黄期急剧下降，其中在变黄前中期（0～48 h），CK、T2 和T3 处理烟叶的抗性淀粉含量急剧下降，降解量分别为54.47%、58.36%和56.18%，T1处理烟叶抗性淀粉含量在变黄中后期（24～72 h）迅速下降，降解量为45.55%。进入定色期之后，4 种处理烟叶的抗性淀粉含量均少量下降。T1 处理烟叶中的抗性淀粉降解时间晚于其他3 个处理，且T1 处理烟叶中的抗性淀粉降解量低于CK、T2 和T3 处理烟叶，说明抗性淀粉的降解可能与变黄期温度相关。综上，烘烤过程中主变黄温度不同，抗性淀粉降解量也存在较大差异，CK、T1、T2、T3 处理烟叶中抗性淀粉降解量分别为64.27%、54.01%、73.34%、63.34%。与当地常规烘烤工艺相比，T2处理烟叶中的抗性淀粉降解量较高，T1 处理烟叶中的抗性淀粉降解量较少，T3 处理烟叶中的抗性淀粉含量与常规烘烤工艺下烟叶的抗性淀粉含量无显著差异。

图5 不同烘烤工艺烘烤过程中的抗性淀粉含量Fig.5 Content of resistant starch in different curing processes

2.4 烤后烟叶抗性淀粉与淀粉组分间的相关性

烤后烟叶抗性淀粉和直链淀粉、支链淀粉之间的相关性见表1。由表1 可知，烤后烟叶抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈显著正相关（r=0.856），烟叶抗性淀粉含量与支链淀粉/直链淀粉无显著关系。

表1 烤后烟叶抗性淀粉与淀粉组分间的相关性Tab.1 Correlation between resistant starch and starch components in roasted tobacco leaves

3 结论与讨论

在大田生长期，烟叶叶片以积累淀粉为主，成熟采收的烟叶经过烘烤调制加工，烟叶内淀粉转化降解[20-23]。本研究中，随着烟叶烘烤的不断进行，细胞内的叶绿体与细胞壁间的间隙不断增大，叶绿体不断降解，叶绿体内的淀粉粒也不断降解，且无序地散落在细胞中，这与刘朝营等[24]的研究结果一致。本研究发现，变黄期是烟叶淀粉降解的主要时期，变黄前中期淀粉大量降解。烟叶烘烤进入定色期后，淀粉酶活性快速下降，淀粉含量无显著变化，可能因为定色期温度影响了淀粉酶活性，进一步影响了淀粉的降解。

本研究中，对烤后烟叶喷洒淀粉酶溶液，发现烤后烟叶中淀粉含量没有显著差异，这说明淀粉中可能存在不能被淀粉酶酶解的组分。结合抗性淀粉的显色反应可知，烤后烟叶中存在抗性淀粉。烤后烟叶中的抗性淀粉可能有2 种来源：一是直链淀粉经湿热处理回生老化，形成难以被淀粉酶水解的抗性淀粉[25]；二是烟叶本身所具有抗性淀粉，且含量随烟叶生长发育不断累积[10]。有研究表明，抗性淀粉含量随水稻生育期的推进呈现递增状态[26]。

本研究通过将常规烘烤工艺与3种主变黄烘烤工艺下烟叶中的直链淀粉和支链淀粉含量进行对比，发现不同主变黄工艺下烟叶中的直链淀粉与支链淀粉含量均随烘烤的持续进行呈下降趋势。低温变黄工艺处理中直链淀粉和支链淀粉大量降解时间晚于当地烘烤工艺、中温变黄工艺和高温变黄工艺处理，低温变黄工艺处理烤后烟叶中直链、支链淀粉含量也显著高于当地烘烤工艺、中温变黄工艺和高温变黄工艺处理，这可能是因为低温变黄工艺处理主变黄温度较低，淀粉酶活性较低，因而导致低温变黄工艺处理淀粉分解不彻底，烤后烟叶淀粉含量高。烘烤48～72 h，中温变黄工艺和高温变黄工艺处理直链、支链淀粉含量与低温变黄工艺处理存在显著差异，说明在烟叶变黄期，适当升高主变黄温度，延长主变黄时间，可有效降低直链淀粉和支链淀粉含量，这与王怀珠等[27]研究结果一致，可能原因是延长主变黄时间可推迟淀粉酶到达活性高峰的时间，有利于直链、支链淀粉的降解。相关性分析结果显示，抗性淀粉与直链淀粉存在显著正相关关系，这与前人[28-30]的研究结果一致。烟叶抗性淀粉含量与直链淀粉含量密切相关，说明在烘烤过程中，可通过调控直链淀粉含量进而调控抗性淀粉含量。

通过设置不同主变黄温度，发现相比于常规烘烤工艺处理、低温变黄工艺和高温变黄烘烤工艺处理，中温变黄工艺处理即延长38 ℃的时间有利于充分降低烟叶中抗性淀粉含量，进而降低烤后烟叶中淀粉含量。高温变黄工艺T3 中的抗性淀粉在烘烤0～48 h 降解量较高，烘烤72 h 之后抗性淀粉少量降解，这可能是因为随着烘烤的不断进行，温度不断升高，烟叶失水困难，影响了淀粉酶等酶活性的发挥，不利于烟叶抗性淀粉的降解。常规烘烤与高温烘烤之间的抗性淀粉含量无显著差异，可能是因为2 个处理烘烤前期烟叶淀粉降解过快，导致后期淀粉停止降解时间较早。低温变黄工艺于变黄初期抗性淀粉降解量较少，烘烤24～72 h，抗性淀粉急剧降解，烘烤72 h 后少量降解，烤后烟叶抗性淀粉含量较高，这可能是因为变黄前期温度较低，且停留时间较长，没有充分激发淀粉酶等酶的活性，进一步影响了抗性淀粉的降解。中温变黄工艺将主变黄温度设置在38 ℃，延长主变黄时间，发现此工艺下抗性淀粉降解量高，且烤后烟叶中抗性淀粉含量低，这可能是因为38 ℃有效激发了降解抗性淀粉相关酶的活性，同时延长了有效的变黄时间。烟叶烘烤环境温度的升高和有效延长关键温度点的时间，可有效降低烟叶抗性淀粉的含量，进一步降低烤后烟叶淀粉含量，这与张潇骏等[31]、宫长荣等[32]研究一致。

综上，烟叶在烘烤变黄期间淀粉大量降解，CB-1烤后烟叶中存在抗性淀粉；烟叶变黄前中期，直链淀粉、支链淀粉以及抗性淀粉均大量降解；烤后烟叶抗性淀粉与直链淀粉间存在显著正相关关系，可通过调控直链淀粉含量进一步调控抗性淀粉含量；相比于常规烘烤工艺、低温主变黄烘烤工艺、高温主变黄烘烤工艺，采用中温主变黄（38 ℃）烘烤工艺、延长主变黄时间能更好地降解烟叶中存在的抗性淀粉，进一步降低烤后烟叶中淀粉含量，提高烟叶CB-1上部叶可用性。