血清HBV RNA的基础与临床应用研究进展

方芷欣 邓芮 孙剑

作者单位：510515 南方医科大学南方医院感染内科

全球约有2.96亿慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，每年有大约50万例患者因HBV相关肝病死亡[1]，因此防治HBV感染是全球重大公共卫生问题。HBV感染进入机体后，可在肝细胞核内形成稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)，目前批准的抗病毒药物如核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素/聚乙二醇干扰素(IFN/Peg-IFN)仍难以彻底清除cccDNA[2]。直接评估cccDNA池需进行有创的肝活检，因此在实际临床实践中接受度不高，亟需无创、有效的替代指标协助监测肝内HBV活跃情况[3]。既往研究表明[4]，传统的HBV标志物如血清HBV DNA、e抗原(HBeAg)和表面抗原(HBsAg)可反映自然史人群的肝内病毒复制情况，但无法准确反映NAs治疗下患者cccDNA的转录活性。近年来，血清HBV RNA被证明可作为一种新型无创指标，用于监测慢性乙型肝炎(CHB)患者肝内cccDNA情况和疾病进展[5]。因此，本文着重概述目前有关血清HBV RNA的分子特征及其临床应用研究进展，为指导CHB治疗提供线索。

一、血清HBV RNA的分子特征

(一)血清HBV RNA的种类、存在形式与分泌途径 HBV侵入肝细胞后，病毒的松弛环状DNA(rcDNA)被转运到细胞核内，形成cccDNA，随后转录出5种具有相同3’末端的mRNA，分别是3.5 kb长的前核心RNA(pcRNA)和前基因组RNA(pgRNA)，2.4/2.1 kb编码表面抗原的mRNA(S mRNA)以及0.7 kb编码X蛋白的mRNA(X mRNA)[5]。研究表明，CHB患者的血清HBV RNA主要为pgRNA[6]，近年发现还含有少量的HBx mRNA[7]。此外，血清HBV pgRNA中除全长的pgRNA外，还观察到大量的3’端截短型pgRNA(无polyA尾，由逆转录过程中病毒聚合酶的RNase H催化产生)，以及不同类型的pgRNA剪接变异体[8]，但何种类型的pgRNA占主导地位仍存在争议，需要区分度更佳、性能更稳健的RNA测序和定量技术来进一步阐明。血清中HBV RNA的存在形式也较为复杂。体外研究发现，细胞上清中的HBV RNA被包装于乙型肝炎核心抗原(HBcAg)组成的核衣壳中，其外可覆盖或不覆盖病毒外包膜HBsAg[8]。在HBV感染者的血清中，除了存在有外包膜包裹的HBV RNA病毒样颗粒外，还存在无病毒外包膜包裹的HBV RNA裸衣壳颗粒，但常以核衣壳-抗体复合物(CACs)的形式存在[9]。近期，有学者提出，血清HBV RNA还可能以外泌体等细胞外囊泡的形式存在于患者血清和细胞上清中，但目前相关研究证据较少。

对于血清中不同存在形式的HBV RNA颗粒，其分泌出胞的途径也有所不同。前期研究发现，包裹有病毒外包膜的HBV RNA病毒样颗粒和HBV DNA病毒颗粒一样，通过多泡小体(MVB)途径分泌至胞外，但目前有关HBV RNA裸衣壳颗粒的分泌途径尚未明确[8]。

(二)HBV RNA病毒样颗粒的感染能力 考虑到CHB患者的血液中存在含有HBV pgRNA的病毒样颗粒，因此有必要了解它们是否能像HBV DNA病毒颗粒那样建立从头感染。首先，由于HBV RNA病毒样颗粒的包膜蛋白结构与HBV DNA病毒颗粒相似，有机会与肝细胞牛磺胆酸钠共转运蛋白(NTCP)受体结合进入胞内。其次，内源性DNA 聚合酶实验(EPA)表明，外周血和细胞上清来源的HBV RNA可在体外逆转录为病毒DNA[8-9]，这进一步表明血清HBV pgRNA病毒样颗粒具有从头感染的潜力。然而，由于HBV RNA病毒样颗粒和DNA病毒颗粒的包膜蛋白组成和密度相似，从HBV DNA颗粒中分离和纯化HBV RNA颗粒在技术上极具挑战性。既往研究通过使用不可逆或可逆的HBV聚合酶抑制剂选择性地富集细胞上清中的HBV RNA病毒样颗粒，发现其均无法在体外建立从头感染[8, 10]。然而，由于体外使用抑制剂富集的大多数HBV RNA病毒样颗粒往往包含的是剪接和末端截短型的pgRNA，现有证据仍不能完全排除全长HBV pgRNA病毒样颗粒的感染性。因此，未来需在不中断病毒聚合酶活性的自然条件下收集和纯化HBV RNA病毒样颗粒，以进一步明确其从头感染能力。

二、血清HBV RNA的临床应用研究进展

HBV属嗜肝DNA病毒科，遗传物质为病毒DNA，HBV RNA作为承接cccDNA与rcDNA的复制中间体，既往认为仅存在于肝细胞内。因此，尽管1996年德国实验室首次报道了HBV RNA存在于病人血清中[11]，当时该发现并未引起学界的重视。此外，由于血清HBV RNA的种类和存在形式多样且复杂，缺乏统一的标准品用于标准化检测和定量，直到2015年后才出现较多有关血清HBV RNA临床应用场景的探索研究，目前相关研究结果主要涵盖以下5个方面：①辅助区分HBV感染自然史过程；②预测患者抗病毒治疗应答；③预测患者NAs停药后复发；④预测患者HBsAg清除；⑤预测患者肝细胞癌(HCC)发生。

(一)血清HBV RNA辅助区分HBV感染自然史 目前针对HBV感染的自然病程，主要依据病毒学指标(HBV DNA水平和HBeAg状态)及生化学指标(ALT)划分为4期，包括免疫耐受期(IT)、免疫清除期(HBeAg+ IA)、免疫控制期(IC)和再激活期(HBeAg- IA)[3]。由于肝脏组织学结果难以获得，依据现行无创指标对CHB患者进行分期易使部分患者划入“灰色阶段”，因此仍需联合其他指标进行完善。血清HBV RNA作为一种新型病毒标志物，具有区分不同感染阶段的潜力。尽管研究发现血清HBV RNA水平在自然病程各阶段的分布规律与HBV DNA水平类似，即IT期患者最高，其次依次为HBeAg+ IA、HBeAg- IA和IC期患者，但与HBeAg、HBV DNA和HBsAg等传统病毒标志物相比，血清HBV RNA在进一步区分处于“灰色区域”的患者方面并无明显优势[12]。未来，有关血清HBV RNA在慢性HBV感染自然史人群中的作用仍需在大样本量且有肝组织学结果的研究中进一步探究。

(二)血清HBV RNA预测患者抗病毒治疗应答 2015年，德国学者首次报道，相较于血清HBV DNA和HBsAg，基线血清HBV RNA水平以及NAs治疗3或6个月后的血清HBV RNA下降水平可更好地预测患者治疗后的HBeAg血清学转换[13]。该研究的发表使血清HBV RNA的临床意义逐渐受到研究人员的重视。随后，国内外学者进一步证实，在IFN治疗的CHB患者中，基线或治疗早期(12周或24周)的血清HBV RNA水平同样可较好预测CHB患者的后续IFN治疗应答情况(包括HBV DNA下降、ALT复常及HBeAg血清学转换)[14-15]。但值得注意的是，在IFN治疗人群中，血清HBV RNA与传统的HBV标志物(包括血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg等)相比，其预测效能并无显著优势[14-15]。基于血清HBV RNA预测 IFN治疗应答的效果欠佳，而目前一线NAs治疗患者大多可有效实现HBV DNA转阴和HBeAg血清学转换，未来血清HBV RNA用于预测抗病毒治疗应答方面的价值较为有限。但值得注意的是，HBV RNA作为一种重要的病毒复制中间体，今后的临床研究设计是否有必要将血清HBV RNA纳入治疗应答的定义仍有待进一步探讨。

(三)血清HBV RNA预测患者NAs停药后复发 相较于HBV DNA等其他病毒指标，HBV RNA来源于cccDNA转录，与cccDNA具有更为直接的上下游关系。CHB患者血清中HBV RNA转阴可能意味着患者肝细胞内cccDNA的清除或转录活性的沉默，也可能预示着CHB患者有望在实现临床治愈(HBsAg清除)之前安全地停用NAs抗病毒治疗。2016年，国内一项小样本量临床研究结果提示，对于NAs治疗过程中达到停药标准而停药的CHB患者，停药时血清HBV RNA阴性的患者在停药后24周时HBV DNA反弹的比例远低于停药时血清HBV RNA阳性的患者(25.0% vs 72.7%，P=0.001)[6]。随后，本研究团队分析了一项前瞻性停药队列中130例停用NAs治疗患者的基线血清HBV RNA水平，发现与停药时血清HBV RNA仍为阳性的患者相比，停药时血清HBV RNA转阴患者的4年累积临床复发率降低约60%，病毒学复发率降低51%[16]。用NAs停药时患者血清HBV RNA水平预测停药后病毒学复发和临床复发，其预测效能优于停药时患者的血清HBV DNA与HBsAg[16]。同时，团队另一研究分析显示，在停用NAs时血清HBV RNA阴性且HBcrAg低水平的患者，其4年累积临床复发率降至0(P<0.001)[17]，进一步说明血清HBV RNA可用于指导“安全”停药，以大幅度减少NAs停药后复发。

(四)血清HBV RNA预测HBsAg清除 除可预测NAs停药后复发外，血清HBV RNA还与NAs停药后HBsAg清除有关。在初始HBeAg阳性的患者中，停药时HBV RNA < 1 000拷贝/mL的患者停药后6年累计HBsAg清除率明显高于停药时HBV RNA高水平的患者(30.9% vs 1.6%，P=0.007)[18]。同样，本团队既往研究发现，停药时血清HBV RNA阴性且HBcrAg低水平的HBeAg阳性患者停药后第4年的HBsAg清除率显著高于其他患者(16.1% vs 1.3%，P=0.002)[17]。然而，对于HBeAg阴性的患者，NAs停药后 HBsAg转阴患者中的血清HBV RNA阴性率虽高于停药后HBsAg持续阳性者，但差异无统计学意义(88% vs 47%，P=0.053)[19]。此外，对于IFN治疗的患者，无论初治时HBeAg状态如何，血清HBV RNA对IFN治疗后HBsAg转阴的预测效能均不如HBsAg定量[15, 20]。

(五)血清HBV RNA预测HCC发生 近来，研究表明CHB患者的血清HBV RNA水平也与HCC发生风险有关。2021年，来自香港的一项小样本量病例对照研究首次发现，HCC组患者在既往治疗过程中的血清HBV RNA阳性率和HBV RNA水平均显著高于非HCC组[21]。随后，本团队基于一项大型前瞻性NAs抗病毒治疗队列，进一步证实高水平血清HBV RNA可增加CHB患者的HCC发生风险[22]。首先，入组时血清HBV RNA阳性患者随访5年的HCC累计发生率显著高于HBV RNA阴性组(4.1% vs 1.8%，P=0.009)。校正其他病毒和非病毒因素后，入组时血清HBV RNA阳性患者的HCC发生风险是RNA阴性组的2.21倍(P=0.005)。进一步根据入组时血清HBV RNA定量结果将患者分为低、中、高水平3组，发现血清HBV RNA水平越高，患者HCC发生风险越高。此外，血清HBV DNA/RNA双阳性患者的HCC发生风险为DNA/RNA双阴性患者的4.02倍(P=0.001)。需要注意的是，以上研究均缺乏抗病毒治疗基线和治疗前的血清HBV RNA数据，未来仍需在更大样本量的研究中进一步探索疾病不同阶段血清HBV RNA 水平及其动态变化与HCC发生、发展的关系。

三、总结与展望

血清HBV RNA的分子特征较为复杂，目前不同实验室采用的扩增靶点和定量方法不同，可能检测到不同种类的HBV RNA，并产生对血清HBV RNA临床价值的不同解读。因此，在将血清HBV RNA广泛应用于临床实践之前，仍有如下问题亟待解决：(1)建立统一的HBV RNA国际标准品，开发灵敏度、特异度和可靠性高的标准化血清HBV RNA定量分析方法或检测试剂盒，以更准确、全面地阐明血清HBV RNA与CHB患者临床转归的关联；(2)需进一步确定不同种类和存在形式的血清HBV RNA在不同临床场景下是否具有特定的预测价值；(3)在抗病毒治疗过程中进一步明确血清HBV RNA的种类和存在形式的组成是否也在发生动态变化，同时这种变化是否与疾病进展和临床预后相关；(4)探究血清HBV RNA在其他临床场景中的应用价值，如明确血清HBV RNA对隐匿性HBV感染患者病毒再激活的预测作用等。

如今，血清HBV RNA作为一种新型无创病毒学标志物，已入选国内外多个有关CHB诊疗的指南和专家共识。未来仍需进一步探究血清HBV RNA的分子生物学特征，同时需借助大样本量的前瞻性研究深入探讨血清HBV RNA本身及其联合传统病毒指标(如HBV DNA，HBsAg和HBeAg等)在更多临床场景中的应用价值，为CHB患者的管理策略提供新思路。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。