miR-219在妊娠期糖尿病大鼠心肌损伤中的作用及其机制

胡丽花，宋成文，袁 明，彭鄂军(中部战区总医院妇产科，武汉 40000；华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科；华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科；通讯作者，E-mail:774560805@qq.com)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在怀孕期间首次诊断出的葡萄糖耐受不良。它是妊娠最常见的并发症之一，更重要的是，在全球育龄女性中，病例数量正在增加，特别是随着肥胖患病率的上升。GDM也是2型糖尿病最重要的危险因素之一，近7%的孕妇会出现GDM并发症[1]。GDM是由于妊娠期间胰岛素抵抗增加导致胰岛β细胞功能障碍，并且对胰岛素抵抗有直接和间接的影响。此外，由于GDM患者c-反应蛋白水平升高，GDM增加了心肌梗死和冠心病的风险[2]。然而，全球缺乏统一的GDM筛查和诊断策略。因此，有必要开发新的潜在分子靶点，以实现对GDM的早期诊断和治疗。越来越多的研究表明，microRNAs(miRNAs)在GDM中具有重要的诊断和治疗价值[3]。miRNA是一组小的非编码RNA，可以通过与调控位点结合，通过翻译抑制或降解来调控靶mRNA的表达。研究发现miRNA通过调控基因在胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗组织中具有重要作用，并参与糖尿病的进展[4]。由于miR-219可调节心肌细胞的增殖能力，已被确定为先天性心脏病的预后靶点[5]。此外，有研究表明，miR-219可以作为糖尿病视网膜病检测的潜在标志物[6]。因此，本研究假设miR-219可能是GDM治疗的有潜力的治疗分子靶点。为了验证这一假设，本研究拟探讨miR-219在GDM发展中的作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 从中部战区总医院实验动物中心购买SPF级健康SD大鼠(体质量200～250 g)。所有大鼠在温度25 ℃，相对湿度58%～68%的动物房中适应1周，可随意获得食物和水。

1.1.2 试剂和仪器 RIPA裂解缓冲液购自北京百奥莱博科技有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技公司；荧光定量检测试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司；ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；Caspase-3和Caspase-9抗体购自美国Abcam公司；NC inhibitor、miR-219 inhibitor、NC-siRNA、GSK-3β-siRNA质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；显微镜购自德国Leica公司；凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 GDM大鼠模型构建与实验分组 通过腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型[7]。实验前采集尾静脉血检测大鼠空腹血糖，血糖正常值设为2.8～5.8 mmol/L。随机选取正常大鼠(雌性70只和雄性35只)并放在笼子里过夜。雌雄大鼠按2 ∶1的比例合笼，第2天清晨在光镜下观察阴道涂片中精子的存在情况，观察到精子阳性定为妊娠第1天。妊娠第10天，选择10只大鼠为对照组(normal组)，注射1 ml柠檬酸盐缓冲液。选择50只妊娠大鼠注射1 ml含有STZ的柠檬酸盐缓冲液。72 h后，采集尾静脉血(采血前禁食10 h)。检测血清空腹血糖，若血糖高于16.7 mmol/L，则GDM大鼠模型构建成功。将50只GDM大鼠随机分为模型组(model组)、抑制物阴性对照组(NC inhibitor组)、miR-219抑制物组(miR-219 inhibitor组)、miR-219抑制物+阴性对照质粒组(miR-219 inhibitor+NC-siRNA组)、miR-219抑制物+GSK-3β-siRNA质粒组(miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA组)，NC inhibitor组、miR-219 inhibitor组、miR-219 inhibitor+NC-siRNA组、miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA组大鼠在构建GDM模型后分别经尾静脉注射10 nmol/L的NC inhibitor、miR-219 inhibitor、miR-219 inhibitor+NC-siRNA、miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA治疗，每3 d一次，共6次。normal组和model组大鼠每3 d给予相同体积的生理盐水。在妊娠第20天实施安乐死，从大鼠尾静脉采集空腹血并取出心肌组织用于后续实验。

1.2.2 各组大鼠血清生化指标检测 大鼠妊娠第20天实施安乐死，从大鼠尾静脉采集空腹血，通过血糖仪检测大鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)值。通过阴离子交换色谱法测定糖化血红蛋白(glucosylated hemoglobin，HbAlc)水平。通过免疫比浊法测定超敏C反应蛋白(high-sensitive C-reactive protein，hs-CRP)水平。用免疫荧光法测定心肌肌钙蛋白I(cardiac troponini，cTnI)水平，用电化学发光免疫分析法测定肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)水平。

1.2.3 苏木精-伊红(HE)染色检测心肌组织病理学变化 大鼠妊娠第20天实施安乐死，解剖并取出大鼠的心肌组织，将心肌组织在4%多聚甲醛中固定24 h，随后在梯度酒精中脱水，二甲苯中透明。将石蜡包埋的标本切成4 μm的连续切片。切片分别用梯度酒精脱蜡和脱水5 min。最后，用蒸馏水冲洗切片并用苏木精染色10 min。蒸馏水清洗后加入0.5%～1%盐酸乙醇进行分离。将切片在自来水下冲洗15 min，0.1%～0.5%伊红染色1 min，自来水下冲洗1 min，梯度酒精脱水，中性树胶封固。最后，在光学显微镜下观察心肌组织病理变化并拍照。

1.2.4 实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测normal组和model组大鼠心肌组织中miR-219、GSK-3β mRNA表达 使用Trizol试剂从心肌组织中提取总RNA。按照说明书使用M-MLV第一链cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。随后在7900HT Fast Real-Time PCR系统中使用SYBR-Green试剂盒进行qPCR反应。反应条件为：95 ℃预变性20 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，共40个循环。U6基因作为miR-219的内部对照，而甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为GSK-3β mRNA的内部对照。使用2-ΔΔCt法检测目的基因的相对表达水平。该实验重复3次。引物序列：miR-219 F:5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAAAC-GCAAT-3′，R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6 F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;GSK-3β F:5′-GACAGTGGTGTGGATCAGTTGGTG-3′，R:5′-GCGATTGCCTCTGGTGGAGTTC-3′;GAPDH F:5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，R:5′-AGCCCA-GGATGCCCTTTAGT-3′。

1.2.5 Western blotting检测大鼠心肌组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达 使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解心肌组织。将20 μg蛋白质加样至10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中进行电泳分离。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭，并与一抗在4 ℃下过夜孵育。然后，用PBST洗涤PVDF膜后，将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育2 h。用ECL发光试剂盒和凝胶成像系统观察蛋白质。使用Image J分析吸光度值。

1.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测大鼠心肌组织中SOD、MDA、NO、NOS水平 将大鼠心肌组织在冰浴中匀浆，并在4 ℃下以4 000 r/min离心15 min。取上清液装入EP管中，并在-20 ℃冰箱中保存。使用ELISA试剂盒根据其说明书测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的含量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验检测miR-219与GSK-3β的靶向关系 合成GSK-3β的3'非翻译区(UTR)的序列，以及相应结合位点的突变序列。两个序列均包含SpeⅠ和HindⅢ限制性核酸内切酶位点。通过使用T4 DNA连接酶将序列插入到pMIR-REPORT载体中。接下来，将GSK-3β野生型(WT)和突变型(MUT)报告质粒分别与miR-219 mimic和海肾荧光素酶报告质粒共转染至细胞中。转染48 h后裂解细胞，离心3～5 min后取上清液。使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶的活性。

2 结果

2.1 miR-219在GDM中的表达以及与GSK-3β的靶向关系

RT-qPCR实验结果显示，与normal组比较，model组大鼠中miR-219水平显著升高，GSK-3β mRNA水平显著降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC inhibitor组比较，共转染GSK-3β-WT的miR-219 inhibitor组荧光素酶活性显著升高(P<0.05)，而共转染GSK-3β-MUT的miR-219 inhibitor组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05，见图1)。

与normal组比较，*P<0.05；与NC inhibitor组比较，#P<0.05图1 miR-219在GDM中的表达以及与GSK-3β的靶向关系Figure 1 Expression of miR-219 in GDM and its targeting relationship with GSK-3β

2.2 miR-219对GDM大鼠血清中FBG、HbAlc水平的影响

与normal组比较，model组和NC inhibitor组大鼠血清中FBG、HbAlc水平显著升高(P<0.05)；与NC inhibitor组比较，miR-219 inhibitor组和miR-219 inhibitor+NC-siRNA组大鼠血清中FBG、HbAlc水平显著降低(P<0.05)；与miR-219 inhibitor+NC-siRNA组比较，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA组大鼠血清中FBG、HbAlc水平显著升高(P<0.05，见表1)。

表1 miR-219对GDM大鼠血清中FBG、HbAlc水平的影响Table 1 Effects of miR-219 on serum FBG and HbAlc levels in GDM rats

2.3 miR-219对GDM大鼠血清生化指标的影响

与normal组比较，model组和NC inhibitor组大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平显著升高(P<0.05)；与NC inhibitor组比较，miR-219 inhibitor组和miR-219 inhibitor+NC-siRNA组大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平显著降低(P<0.05)；与miR-219 inhibitor+NC-siRNA组比较，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA组大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平显著升高(P<0.05，见表2)。

表2 miR-219对GDM大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平的影响Table 2 Effects of miR-219 on serum levels of hs-CRP， cTnI and CK-MB in GDM rats

2.4 miR-219对GDM大鼠心肌组织病理改变的影响

normal组心肌细胞核清晰，细胞排列整齐，无明显病理改变。model组和NC inhibitor组心肌细胞排列紊乱，心肌纤维水肿严重，心肌细胞空泡变性，部分肌原纤维断裂，横纹消失。与NC inhibitor组比较，miR-219 inhibitor组心肌病理变化明显减轻，心肌细胞排列较整齐，仅有少量心肌纤维肿胀。与miR-219 inhibitor+NC-siRNA组比较，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA组心肌损伤加重，心肌细胞排列较紊乱，大量肌原纤维结构断裂(见图2)。

图2 miR-219对GDM大鼠心肌组织病理改变的影响 (HE染色)Figure 2 Effect of miR-219 on pathological changes of myocardial tissue in GDM rats (HE staining)

2.5 miR-219对GDM大鼠凋亡蛋白水平的影响

与normal组比较，model组和NC inhibitor组大鼠心肌组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著升高(P<0.05)；与NC inhibitor组比较，miR-219 inhibitor组和miR-219 inhibitor+NC-siRNA组大鼠心肌组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著降低(P<0.05)；与miR-219 inhibitor+NC-siRNA组比较，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA组大鼠心肌组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著升高(P<0.05，见图3)。

与normal组比较，*P<0.05；与NC inhibitor组比较，#P<0.05；与miR-219 inhibitor+NC-siRNA组比较，&P<0.05图3 miR-219对GDM大鼠凋亡蛋白水平的影响Figure 3 Effect of miR-219 on the level of apoptotic proteins in GDM rats

2.6 miR-219对GDM大鼠氧化应激水平的影响

与normal组比较，model组和NC inhibitor组大鼠心肌组织中SOD、NOS活性和NO含量降低，MDA含量升高(P<0.05)；与NC inhibitor组比较，miR-219 inhibitor组和miR-219 inhibitor+NC-siRNA组大鼠心肌组织中SOD、NOS活性和NO含量升高，MDA含量降低(P<0.05)；与miR-219 inhibitor+NC-siRNA组比较，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA组大鼠心肌组织中SOD、NOS活性和NO含量降低，MDA含量升高(P<0.05，见图4)。

与normal组比较，*P<0.05；与NC inhibitor组比较，#P<0.05；与miR-219 inhibitor+NC-siRNA组比较，&P<0.05图4 miR-219对GDM大鼠氧化应激水平的影响Figure 4 Effect of miR-219 on oxidative stress level in GDM rats

3 讨论

研究报道，miRNA涉及各种生物活性，包括内分泌和代谢性疾病、癌症等。例如，miR-219通过靶向HMGA2抑制卵巢癌细胞的生长和转移[8]。miR-219通过调控NMDAR信号通路降低T2DM小鼠海马神经元细胞凋亡[9]。近期，越来越多的研究发现miRNA可作为预测GDM的重要生物标志物[10，11]。本研究发现miR-219在GDM大鼠中的表达显著升高，表明miR-219可能会有助于GDM的诊断。因此，为了进一步探讨miR-219的作用机制，本研究通过将miR-219 inhibitor注射至大鼠体内进行研究。

既往研究表明FBG和HbA1c水平升高是糖尿病的诊断指标[12]。本研究结果显示model组大鼠血清中FBG和HbA1c水平升高，这与之前的研究一致。下调miR-873可降低FBG、HbAlc水平，提示下调miR-873可能与GDM的改善有关。由于高葡萄糖环境，GDM患者所生婴儿患心血管畸形的风险增高[13]。然而，对妊娠期糖尿病心脏病发病机制的分子基础研究尚未明确揭示其发病机制。之前有研究报道心肌细胞减少和凋亡细胞增加导致高血糖状态下的心脏缺陷[14]，但仍需要更多研究来阐明其机制。心肌损伤是2型糖尿病常见的并发症，其中，hs-CRP、CK-MB和cTnI被认为是心肌损伤的重要指标[15]。本研究结果发现miR-219下调可通过降低cTnI、CK-MB和hs-CRP的表达来减轻心肌损伤。已知Caspase在细胞凋亡的终末执行阶段发挥重要的作用，并且Caspase-3被认为是Caspase的执行者，Caspase-9被认为是Caspase的启动者[16]。此外，研究发现miR-219过表达显著促进甲状腺癌细胞凋亡[17]。本研究结果发现miR-219下调降低凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的水平，表明下调miR-219可抑制心肌细胞凋亡。SOD和MDA是氧化应激的重要指标，氧化应激在糖尿病发生发展中起着重要作用[18]。由于氧化应激水平较高，由NOS的转录和翻译后调节引起的NO生物利用度在GDM中降低[19]。先前的研究表明miRNA参与氧化应激的调节[20]。本研究结果表明抑制miR-219可升高SOD和NOS活性以及NO含量，降低MDA含量，表明miR-219下调可以抑制GDM氧化应激水平。

糖原合成酶激酶3(GSK3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于从酵母到哺乳动物的生物体中。GSK3亚型由两个不同的基因编码：GSK-3α和GSK-3β。糖原生成主要通过与GSK-3β密切相关的酶来调节，这种酶可以抑制糖原合成并诱导胰岛素抵抗[21]。研究已经证实GSK-3β与2型糖尿病风险之间存在密切关联[22]。此外，有文献表明GSK-3β在缺血再灌注损伤期间可起到保护心脏的作用[23]。本研究探讨了GSK-3β在母体糖尿病引起的心脏异常和心肌细胞凋亡中的作用，结果表明抑制miR-219可以通过靶向GSK-3β进而抑制GDM大鼠心肌损伤。

总之，miR-219下调可能通过靶向GSK-3β来调节GDM中的心肌损伤。因此，miR-219在未来可能成为GDM的治疗靶点。然而，在将来还需要进一步的研究来充分了解miR-219对GDM中心肌损伤调控的具体机制。