miR-126-3p过表达对宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响及作用机制

徐子杰，聂晓瑞，郑 华(北京市朝阳区妇幼保健院妇科，北京 100025；通讯作者，E-mail:xuzij8508888@163.com)

宫颈癌是妇科恶性肿瘤中最为常见的一种疾病，在全球女性恶性肿瘤中排第二位，仅次于乳腺癌[1]。研究表明[2]，全球每年宫颈癌的新发病例超过50万，每年的死亡人数大约为20万，在妇科恶性肿瘤中，宫颈癌的死亡率稳居首位。据报道，在转移性和复发性宫颈癌患者中，通过mTOR途径上调的磷酸肌醇3激酶(PI3K)、AKT蛋白表达可引起宫颈癌细胞凋亡[3]。MicroRNA(miRNA)是内源性的19-25聚体非编码小RNA，通过与靶信使RNA(mRNA)的3′-非翻译区(3′-UTR)碱基配对来调节基因[4]。有研究指出，miR-126-3p可在肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌和前列腺癌等多种癌症中，通过抑制癌基因发挥抑癌作用或通过抑制肿瘤抑制因子作为肿瘤促进剂[5-7]。既往研究表明，miR-126-3p在宫颈良性肿瘤中可通过靶向PI3K亚基p85β(PIK3R2)3′-UTR中的一个位点，调控AKT蛋白表达，影响患者病情发展[8]。然而，miR-126-3p在宫颈癌中的作用及其与PI3K/PDK1/AKT通路相关的分子机制尚未完全阐明。笔者就此进行研究，观察miR-126-3p对宫颈癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

宫颈癌HeLa细胞株购自北京生物技术有限公司。miR-126-3p模拟物购自中国上海GenePharma公司；膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自北京生物海洋生物技术有限公司；DAPI染色试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司等。细胞计数器(上海上碧实验仪器有限公司)；DM 750型光学显微镜(日本Olympus公司)；Spectra Max M5型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；XDS-3型倒置显微镜(青岛爱普科生物工程有限公司)；Biotek Lionheart FX活细胞成像分析系统(北京德泉兴业商贸有限公司)等。

1.2 实验方案

宫颈癌HeLa细胞在含有10% FBS和1%抗生素抗真菌溶液、两性霉素B和链霉素的DMEM培养基中培养，环境温度37 ℃，CO2浓度5%，48 h后接种至18份相同培养基中继续培养。培养48 h后其中9株作为对照，进行常规培养，其余9株为miR-126-3p过表达组，使用miR-126-3p模拟物构建载体质粒并转染，24 h后进行指标检测。载体构建方案见图1。过表达组基因表达量为对照组2倍及以上判定为模型构建成功，模型构建完成后使用qPCR检测细胞miR-126-3p基因表达量。

图1 载体构建方案图Figure 1 Scheme of vector plasmid construction

1.3 指标检测

1.3.1 MTT细胞增殖试验检测细胞存活率 将细胞接种至96孔板中。将MTT溶液(2 mg/ml)加入细胞培养物中，并在37 ℃下绝对黑暗中孵育4 h。

将甲臜或紫色沉淀溶解在DMSO(100 μl)中，轻轻摇动。完全溶解后，使用酶标仪测定读数器通过MTT测定法检测细胞增殖，在490 nm处评估吸光度，细胞存活率=细胞存活量/对照组细胞存活量×100%。

1.3.2 DAPI染色检测凋亡小体 转染后，将多个细胞株在96孔中培养24 h。用多聚甲醛洗涤和固定细胞并孵育1 h。然后再次洗涤细胞并加入Triton X-100溶液并孵育10 min。用PBS重新洗涤后，将细胞与DAPI溶液一起温育，倒置显微镜下观察细胞核的形态变化，观察细胞核凋亡小体表现。

1.3.3 Wright染色法检测细胞迁移 细胞迁移通过在Boyden室中通过8 μm孔聚碳酸酯过滤器(孔隙率，8 μm；Costar，Appleton Woods，伯明翰，英国)定向迁移的细胞数量来量化。简而言之，过滤器的下表面涂有10 mg明胶。HeLa细胞被血清饥饿过夜并重新悬浮在无血清培养基中，然后将200 μl细胞悬浮液以1×106/ml的终浓度替换到每个孔的上室中。将含有FBS(10%)的培养基添加到底部室中，让细胞在37 ℃下迁移6 h。用棉签去除上膜表面上未迁移的细胞。附着在下膜表面的迁移细胞用含4%多聚甲醛的PBS固定，并用Wright染色法染色。使用标准显微镜以400倍的放大倍数计数细胞，并记录5个随机视野中的平均细胞数/视野。使用一式三份过滤器，实验重复3次。

除滤膜上表面涂有25 μg Matrigel，将细胞浓度调整为2×105个/ml，时间延长至24 h外，侵袭试验同上。

1.3.4 划痕实验检测侵袭量和细胞侵袭率 以5×105个/ml的浓度接种宫颈癌细胞在添加5%FBS的2 ml Ham’s F12的6孔板培养基中。用无菌200 μl移液管尖端转染融合单层培养细胞，制作划痕，并使用与Axio-Observer显微镜(Carl Zeiss)耦合的数码相机系统在0，24，48 h显微镜拍照。通过ImageJ 1.60软件测量伤口闭合，并计算伤口闭合率(=迁移细胞表面积/总表面积×100%)。

1.3.5 流式细胞术检测细胞周期 将HeLa细胞接种在6孔板(3×105)中并孵育过夜以使其黏附。然后将芦丁处理的细胞用胰蛋白酶消化，500g离心(5 min，重悬于PBS溶液中，然后在4 ℃的70%乙醇中固定4 h。之后，细胞用PBS洗涤两次，并在37 ℃下用0.1 mg/ml RNase A处理30 min。最后，将细胞用含有0.1% Triton X-100、0.025 mg/ml PI的DNA染色溶液在黑暗中染色30 min。使用流式细胞仪通过流式细胞术分析荧光细胞。

1.3.6 蛋白印迹检测Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白表达 使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并使用含有1 mol/L PMSF、1 mol/L原钒酸钠和等浓度完全蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液裂解。在冰上孵育30 min后，将细胞裂解物研磨并在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min。将澄清的上清液保存为全细胞裂解液。裂解液加载到10%十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳上，电泳80 V 30 min和120 V 60 min，然后电转移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h。然后，将膜与Bax、Bcl-2、Casepase-3抗体(稀释度1 ∶100)4 ℃过夜，然后清洗膜并与适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1 h。最后，使用增强型化学发光检测系统(Clinx Science Instruments， U.S.A.)观察蛋白质条带。测量β-catin表达水平作为内源参考并用于标准化。根据2-ΔΔCt方法计算蛋白的相对表达。

1.3.7 Q-PCR检测miR-126-3p表达量 使用miRNeasy Mini Kit提取总RNA，并按照PrimeScript RT试剂盒的说明逆转录成cDNA。然后，在ABI7500定量PCR仪器中，如SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒(RR820A；Takara)说明书中所述，将cDNA进行荧光定量聚合酶链反应(PCR)。miR-126-3p引物由Takara设计合成(正向引物：5′-GGGGTCGTACCGTGAGT-3′，反向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′)。使用相对定量方法(2-ΔΔCt)计算miR-126-3p相对于β-catin的mRNA表达。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组miR-126-3p表达

转染后，对照组miR-126-3p相对表达量为1.04±0.11，miR-126-3p过表达组miR-126-3p相对表达量为3.14±0.28，两组间比较差异有统计学意义(t=20.942，P=0.000)，提示模型构建成功。

2.2 两组细胞活力比较

miR-126-3p过表达组HeLa细胞存活率显著低于对照组(78.27%±5.41%vs100.00%±0.00%，t=12.050，P<0.05)。DAPI染色结果显示，miR-126-3p过表达处理的细胞显示出凋亡小体(细胞核破碎和凝聚)，而对照组未显示出明显的细胞凋亡(见图2)。

A.对照组 B. miR-126-3p过表达组图2 两组DAPI细胞活力检测结果 (×200)Figure 2 Cell viability in two groups by DAPI (×200)

2.3 两组细胞周期比较

miR-126-3p过表达组G0/G1周期细胞占比显著高于对照组，S周期细胞占比显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 两组细胞周期比较Table 1 Comparison of cell proportion between the two

2.4 两组细胞迁移比较

miR-126-3p过表达组细胞迁移量和细胞迁移率显著低于对照组(P<0.05，见表2)，细胞迁移结果见图3。

表2 两组细胞迁移比较Table 2 Comparison of cell proliferation and migration between the two

A.对照组 B. miR-126-3p过表达组图3 Wright染色法检测两组细胞迁移结果Figure 3 Cell migration results in two groups by Wright staining

2.5 两组划痕实验结果比较

与对照组相比，miR-126-3p过表达组细胞中侵袭的细胞数减少(见图4)，转染24 h和48 h，miR-126-3p过表达组平均细胞侵袭率显著于低于对照组(22.03±7.10vs35.47±5.54；28.52±5.19vs57.83±10.78)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.6 两组Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白相对表达量比较

miR-126-3p过表达组Bax和Casepase-3蛋白相对表达量显著高于对照组，Bcl-2蛋白相对表达显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，见图5)。

与对照组比较，*P<0.05图5 两组Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白相对表达量比较Figure 5 Comparison of the relative expression levels of Bax， Bcl-2 and Casepase-3 between the two groups

2.7 两组p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相对表达量比较

miR-126-3p过表达组p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图6)。

与对照组比较，*P<0.05图6 两组p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相对表达量比较Figure 6 Comparison of the relative expression levels of p85β， p-PDK1 and p-AKT between the two groups

3 讨论

宫颈癌是肿瘤相关死亡率的第四大原因，是全球常见的妇科肿瘤，宫颈癌细胞在宫颈癌发生过程中会发生一系列变化，包括基因组不稳定的诱导、细胞增殖的失调、细胞周期控制机制的破坏以及某些癌基因和肿瘤抑制基因的异常表达[9]。肿瘤病情发生发展与不受控制的细胞增殖及细胞周期等细胞生物行为学密切相关[10]。

细胞凋亡是维持细胞环境动态平衡的基本程序性细胞死亡过程，Caspase激活是细胞凋亡诱导相关的关键途径之一。Caspase-3，一种效应子或执行型Caspase，识别并分离各种靶蛋白中的短氨基酸序列，诱导细胞凋亡[11]，可通过分离Bid蛋白从而进一步与Bax结合，促进细胞色素c释放，引起细胞凋亡[12]。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax组成。Bcl-2是著名的具有代表性的凋亡抑制因子，而Bax可以与Bcl-2结合形成异源二聚体，拮抗Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，促进细胞凋亡。另一方面，Bax还激活Caspase-3，促进Ca2+释放，进而导致细胞凋亡。Caspase-3作为代表性的执行者在细胞凋亡中起着举足轻重的作用。因此，Bax、Bcl-2和Caspase-3水平被认为是评价细胞凋亡的指标。本研究中，miR-126-3p过表达导致Caspase-3、Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达降低，表明miR-126-3p过表达可以通过线粒体介导或外在途径诱导细胞凋亡，减少癌细胞增殖。此外，本研究发现，miR-126-3p过表达组细胞活力显著低于对照组。此外，肿瘤病情发生发展与不受控制的细胞周期密切相关，细胞周期分析结果显示，miR-126-3p过表达在G0/G1期阻止了宫颈癌细胞的细胞周期进程，诱导细胞周期停滞。同时，癌细胞转移、侵袭是引起患者病情进展的重要因素，病灶内的细胞外基质及基底膜过度降解、细胞上皮间质转化过程增强等情况，癌细胞向腹腔播散及远处转移，称为肿瘤侵袭。在体外实验中，细胞侵袭试验及划痕实验是对癌细胞转移、侵袭能力最直观表现，本研究可见，miR-126-3p过表达可降低HeLa细胞侵袭、转移能力。

进一步对其作用机制分析，Akt是人类癌症中最常见的过度活化激酶之一，在细胞迁移中起重要作用[13]。有研究指出[14]，磷酸化AKT可诱导磷酸化GSK3β(无活性形式)，去磷酸化GSK3β(活性形式)可抑制细胞周期蛋白D1，磷酸化GSK3β的非活性形式诱导细胞周期蛋白D1表达。因此，miR-126-3p下调的磷酸化AKT可能通过下调cyclin D1来抑制细胞更新。此外，抑制PI3K/Akt通路可导致宫颈癌细胞凋亡[15]。我们的研究结果表明，miR-126-3p对PI3K/Akt通路的抑制通过促进Caspase-3活性抑制宫颈癌细胞增殖。同时，活化的AKT和mTOR是宫颈癌预后不良的指标[16]。在临床试验中，PI3K/AKT/mTOR抑制剂已被用作宫颈癌的分子靶向治疗，并且发现PI3K/AKT抑制剂LY294002可增加宫颈癌细胞系的放疗敏感性[17，18]。本研究结果发现，miR-126-3p过表达组p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相对表达量显著低于对照组，证实miR-126-3p过表达能通过调控宫颈癌细胞PI3K/PDK1/AKT蛋白通路抑制其细胞活力、迁移和侵袭。

本研究还存在一些不足：受miR-126-3p和p85β的强制表达采用瞬时转染技术而不稳定影响，难度较高，因此本研究未对p85β是否可以逆转miR-126-3p的作用进行分析。如果能够证明miR-126-3p靶基因与PI3K/PDK1/Akt通路的抑制之间的直接联系，情况将会更加清楚，但本研究创新点的优势在于证实了miR-126-3p过表达影响了细胞中与PI3K/AKT通路相关的蛋白及肿瘤转移、侵袭相关因子表达水平，发现miR-126-3p影响PI3K/PDK1/AKT信号通路级联反应。

综上，miR-126-3p过表达能通过调控宫颈癌细胞PI3K/PDK1/AKT蛋白通路抑制其细胞活力、迁移和侵袭，诱导癌细胞细胞周期停滞，外源性miR-126-3p及其靶分子可能成为miRNA的宫颈癌治疗新靶点。