乌头汤调控lncRNA GAS5抑制骨关节炎软骨细胞炎症反应的研究

涂海水　邱志伟　金灵璐　郑志煌　李莹莹　陈毅涛　李超　付长龙

【摘 要】目的：探讨乌头汤调控lncRNA GAS5进而干预白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的软骨细胞炎症反应的效果及机制，为乌头汤的临床应用提供实验依据。方法：4周龄SPF级SD雄性大鼠10只，提取大鼠双膝关节软骨，进行体外软骨细胞的分离与培养，采用Ⅱ型胶原免疫组化法对软骨细胞进行鉴定；经10 ng·mL^-1IL-1β干预24 h诱导软骨细胞退变。将软骨细胞随机分为空白对照组、模型对照组（10 ng·mL^-1IL-1β）和乌头汤组（150 μg·mL^-1乌头汤水提物）。通过Real-time PCR检测各组软骨细胞中lncRNA GAS5的相对表达水平。免疫荧光染色技术检测软骨细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和解聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）的荧光表达量。結果：与空白对照组比较，模型对照组lncRNA GAS5相对表达水平显著升高（P < 0.01），TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5荧光表达增强；与模型对照组比较，乌头汤组lncRNA GAS5相对表达水平显著降低（P < 0.01），TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5荧光表达显著减弱。结论：乌头汤可抑制骨关节炎软骨细胞炎症反应，维持软骨细胞外基质稳态，与调控lncRNA GAS5相对水平表达有关。

【关键词】 骨关节炎；乌头汤；炎症反应；软骨细胞外基质；大鼠

Study on the Effect of Wutou Tang（乌头汤）on lncRNA GAS5 Inhibiting the Inflammatory Reaction of Chondrocytes in Osteoarthritis

TU Hai-shui，QIU Zhi-wei，JIN Ling-lu，ZHENG Zhi-huang，LI Ying-ying，CHEN Yi-tao，LI Chao，FU Chang-long

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect and mechanism of chondrocyte inflammatory reaction of Wutou Tang（乌头汤）on the regulation of lncRNA GAS5 and the intervention of interleukin-1β（IL-1β），provide experimental basis for clinical application of aconite soup.Methods：Ten SPF grade SD male rats at the age of 4 weeks were used to extract the articular cartilage of both knees of the rats and isolate and culture the chondrocytesin vitro.The chondrocytes were identified by typeⅡ collagen immunohistochemistry.After 10 ng·mL-1 IL-1β intervention for 24 hours induced chondrocyte degeneration.Chondrocytes were randomly divided into blank control group and model control group（10 ng·mL-1 IL-1β）and aconite soup group（150 μg·mL-1）.The relative expression level of lncRNA GAS5 in chondrocytes of each group was detected by Real-time PCR.The expression of TNF-α，MMP-3 and ADAMTS-5 in chondrocytes was detected by immunofluorescence staining.Results：Compared with the blank control group，the relative expression level of lncRNA GAS5 in the model control group was significantly higher（P < 0.01）.The fluorescence expression of TNF-α，MMP-3 and ADAMTS-5was enhanced.Compared with the model control group，the relative expression level of lncRNA GAS5 in aconite decoction group was significantly lower（P < 0.01）.The fluorescence expression of TNF-α，MMP-3 and ADAMTS-5 was significantly decreased.Conclusion：Wutou Tang can inhibit the inflammatoryreaction of chondrocytes in osteoarthritis and maintain the stability of extracellular matrix of cartilage，which is related to the regulation of the relative level of expression of lncRNA GAS5.

【Keywords】 osteoarthritis;Wutou Tang（乌头汤）;inflammatory reaction;extracellular matrix of

cartilage;rats

骨关节炎（osteoarthritis，OA）属中医学“痹证”范畴，多由人体肝肾亏虚，筋骨肌肉失养，外复感风寒湿邪，导致经络痹阻、气血运行不畅，关节失于濡养，局部不通则痛，最终引起关节功能障碍［1-2］，属本虚标实之证。目前针对OA的阶梯治疗分为基础治疗、药物治疗、修复性治疗以及重建治疗。其中药物治疗占有很大的比重，包括非甾体抗炎药、关节腔注射药物、抗焦虑药物以及中药等［3］。但是非甾体抗炎药治疗常常伴随着肝肾功能损伤、血液系统损伤、脂质代谢和（或）水盐代谢紊乱、消化道刺激等不良反应，而手术治疗也存在高风险、高价格的缺点，且有1/3的患者出现术后疼痛或者功能没有明显的改善［4］。乌头汤是治疗骨痹的经典方剂，在治療OA中被国内专家共识高度推荐［5］。

近年来研究发现，生长阻滞特异性转录因子5（GAS5）在OA患者中表达升高，lncRNA GAS5可以通过调节软骨细胞增殖与凋亡、炎症、自噬以及软骨细胞外基质（ECM）降解加剧OA进程［6-7］。因此，本研究从炎症和软骨基质稳态的角度出发，探讨乌头汤是否可以通过调控lncRNA GAS5的表达，降低下游肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和解聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）的水平，抑制白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的软骨细胞退变。

1 实验材料

1.1 实验动物 4周龄SPF级SD雄性大鼠10只，体质量为（90±10）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养环境温度23～25 ℃，湿度55%～60%，循环光照条件自动控制在12 h光/暗循环。实验动物饲养环境和饮食条件均符合福建中医药大学实验动物中心标准，实验动物使用许可证号SYXK（闽）2019-0007。

1.2 实验药物 由福建中医药大学附属第三人民医院提供，包括制川乌6 g，麻黄、黄芪、炙甘草和芍药各9 g。乌头汤水提物的制备：制川乌先煎1 h后，依次将其余4味中药共同加入再次煎煮1 h；除去乌头汤中残渣，过滤出乌头汤药液，制备乌头汤水提物，配成 10 mg·mL-1乌头汤水提物母液，备用。

1.3 实验试剂和仪器 IL-1β试剂（批号MKCL5731，美国Sigma公司）；Collagen Ⅱ抗体（货号ab188570，批号GR3233600-8，美国Abcam公司）；TNF-α抗体（货号17590-1-AP，批号00077108，美国Proteintech公司）；MMP-3（货号bs-0413R，北京博奥森生物技术有限公司）和ADAMTS-5抗体（货号bs-3573R，北京博奥森生物技术有限公司）；RNA提取试剂（货号R401-01，批号7E490L0，南京诺唯赞公司）；逆转录试剂盒（货号R211-02，批号7E460H0，南京诺唯赞公司）；ELx800全自动酶标仪（美国Bio-TEK公司）；CFX96 Touch实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 软骨细胞培养及鉴定 大鼠经5%异氟醚在2 L·min^-1氧气中吸入麻醉，并维持在2%异氟醚中。将大鼠双膝及周围部位以体积分数为75%的乙醇消毒，然后用眼科小剪从大鼠踝关节处剪开皮肤，往大腿方向延伸，暴露出下肢肌肉。剔除肌肉后用咬骨钳分离出双膝关节，用质量分数为0.9%的生理盐水洗去关节部位的肌肉、毛发。将膝盖浸泡在体积分数为75%的乙醇下带入提前紫外线消毒过后的超净台内操作。剃取透明软骨置于无菌培养皿内，将其切碎至1 mm3大小。加入质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶消化，待消化完全后转移至无菌离心管中，以1000 r·min^-1离心5 min，离心半径12.29 cm；去除上层上清液，往下层沉淀组织中加入含有质量分数为10% FBS的DMEM终止消化，并将其转移到培养瓶中培养。镜下观察到软骨细胞占满培养瓶的80%时进行传代培养。观察到第2代软骨细胞形态较好，胞浆丰富，因此，选择第2代软骨细胞进行后续实验。

采用Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色法对第2代软骨细胞进行鉴定，分为阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组加入Collagen Ⅱ抗体（1∶200）；阴性对照组加PBS作为对照，在4 ℃条件下孵育过夜，隔天PBS冲洗后加入二抗，在室温条件下反应30 min，经PBS清洗后使用DAB室温浸润显色，复染时使用苏木素浸润30 s，然后用PBS溶液返蓝，最后经脱水和中性树胶封片，在光学显微镜下进行观察、摄片和分析。

2.2 实验分组 本研究将软骨细胞随机分为空白对照组、模型对照组和乌头汤组。根据课题组前期研究基础，第2代软骨细胞在2 mL培养基中以1×10⁵·mL^-1密度接种到6孔板中，模型对照组采用10 ng·mL^-1IL-1β干预24 h诱导软骨细胞退变，24 h后更换2 mL新鲜培养基（含有质量分数为10% FPS的EDEM）继续培养［8］。课题组前期通过MTT法测定乌头汤对软骨细胞活性的影响，发现150 μg·mL^-1乌头汤水提物干预24 h具有较好的效果［9］。在6孔板乌头汤组中采用10 ng·mL^-1IL-1β干预24 h后，更换为150 μg·mL^-1乌头汤水提物继续培养24 h。

2.3 Real-time PCR检测各组软骨细胞中lncRNA GAS5的相对表达水平 根据Trizol试剂说明书提取软骨细胞总RNA，将传代后的第2代软骨细胞悬液转移到6孔板中，密度为1×10⁵·mL^-1，每个孔添加Trizol消化软骨细胞。随后根据逆转录试剂盒操作步骤建立逆转录体系，设置条件为37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，最后4 ℃ forever进行逆转录。对Real-time PCR扩增曲线和溶解曲线进行确认，使用2－△△CT方法比较目的基因与内参基因平均CT值差异，并对结果进行定量。Real-time PCR相关引物见表1。

2.4 免疫荧光染色技术检测各组软骨细胞中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的荧光表达量 各组软骨细胞在室温下用体积分数为10%的正常山羊血清孵育1 h，PBS清洗后加入抗体（TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5）于4 ℃条件下孵育过夜。隔天PBS洗涤干净后，将其分别孵育在带有异硫氰酸荧光素（FITC）标记或CY3荧光染料的山羊抗兔多克隆抗体中，室温避光1 h，以DAPI染色法对软骨细胞的细胞核进行标记，放置于镜下观察并拍照记录。

2.5 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，当差异有统计学意义时，进行多重比较，方差齐时采用LSD分析法，方差不齐时采用Games Howell法，统计检验均采用双侧检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞鉴定结果 第2代软骨细胞经Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色后，软骨细胞胞核呈现蓝色且清晰可见。阳性对照组胞浆区呈现棕黄色，见图1（1）；阴性对照组胞浆区不着色，见图1（2）。

3.2 各组软骨细胞中lncRNA GAS5相对表达水平比较 Real-time PCR结果显示，与空白对照组比较，模型对照组lncRNA GAS5相对表达水平显著升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，乌头汤组lncRNA GAS5相对表达水平显著降低（P < 0.01）。见表2。

3.3 各组软骨细胞中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的荧光表达量比较 在不同染色后可以观察到TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5免疫荧光染色呈现出清晰的绿色和红色。软骨细胞核在DAPI染色下均表现为蓝色；与空白对照组比较，模型对照组中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5荧光表达更强，经过乌头汤干预后荧光表达降低。见图2、图3、图4。

4 讨 论

根据OA发病特征和临床特点，属中医学“痹证”范畴。《黄帝内经》记载多种疾病的痹证，而OA属于肢体关节的“骨痹”范畴。《素问·长刺节论篇》曰：“痛在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”说明骨痹是由于骨髓空虚，寒邪乘虚而入，导致肢体疼痛沉重，抬举无力。《医宗必读》认为，骨痹就是寒痹和痛痹的结合，可见四肢挛急，关节疼痛、肿胀。中医治疗骨痹，依据辨证论治可以针对性地运用活血止痛、补益肝肾、祛风散寒、利水消肿等多种方法。乌头汤出自《金匮要略》，是临床治疗OA的经方之一，全方由制川乌、麻黄、黄芪、芍药和炙甘草5味中药组成。方中制川乌为君药，性辛热，主散寒除湿，止关节痹痛。李具宝等［10］统计491篇中药治疗OA的文献，发现制川乌是用药频率最高的药物，为28%。多项临床研究证实，乌头汤治疗OA疗效良好，具有温阳散寒通络、除湿止痛的功效［11］。生物信息学和分子对接研究证实，乌头汤可以抑制MMPs的水平防止ECM降解，维持关节软骨结构完整性［12］。现代药理学研究表明，乌头汤能抑制OA患者血清中IL-1β、TNF-α、MMPs水平，从而减轻炎症反应，抑制ECM降解［13］。

lncRNA GAS5在生长停滞期间普遍高表达，近年来被发现可以促进OA发展［14］。针对lncRNA GAS5的敲除可促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡，导致OA软骨细胞G1期阻滞［6］。在OA软骨细胞中lncRNA GAS5表达上调，miR-21表达下调，lncRNA GAS5作为miR-21的负调节因子，刺激软骨ECM降解［7］。在OA患者中，MMPs和ADAMTS的异常升高导致软骨ECM稳态失衡，降解超过合成，加剧了软骨退变。TNF-α等炎症因子同样会促进MMPs和ADAMTS的表达，进而参与这种动态平衡［15］。本研究从炎症和软骨基质稳态的角度出发，通过检测TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的表达，探讨乌头汤是否可以通过调控lncRNA GAS5的表达，抑制IL-1β诱导的软骨细胞退变。Real-time PCR结果显示，IL-1β诱导后软骨细胞中lncRNA GAS5水平升高，并且这个趋势在乌头汤干预后得到抑制，说明乌头汤可以通过抑制lncRNA GAS5的表达延缓软骨细胞退变。

本研究免疫荧光结果显示，IL-1β诱导后软骨细胞中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5荧光表达量增加，而在乌头汤干预后荧光表达量减弱。TNF-α是与OA发展密切相关的炎症介质，OA患者通常伴有软骨细胞中TNF-α过度表达，与OA的严重程度呈正相关［16］。抑制TNF-α水平可以促进软骨修复，改善关节炎症状［17］；同时，TNF-α也可诱导MMPs和ADAMTS的表达促進ECM降解［18］。ECM主要由Ⅱ型胶原和蛋白多糖组成，MMP-3是OA的重要调节因子，它作为一种具有强大破坏性的蛋白酶，可以降低胶原蛋白和蛋白多糖的表达，在ECM的生理转换中发挥作用，并激活其他胶原酶［19-20］。ADAMTS-5属于ADAMTS家族，通过切割聚集蛋白聚糖导致ECM中蛋白多糖的降解［21］，蛋白多糖被水解后吸引水分子的能力下降，关节软骨抗压能力减弱，进一步诱导关节软骨退化［22］。因此，在IL-1β诱导的退变软骨细胞中，TNF-α作为重要的促炎细胞因子，诱导MMP-3和ADAMTS-5表达，通过降解蛋白多糖以及切割胶原蛋白导致ECM降解；而经过乌头汤干预后可以通过抑制TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的表达延缓软骨细胞退变。

综上，本研究结果表明，乌头汤可以抑制lncRNA GAS5表达，降低下游TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5水平，抑制软骨细胞炎症反应，防止ECM降解，从而延缓关节软骨退变。本研究探讨了乌头汤治疗OA退变软骨细胞的作用机制，但是未涉及乌头汤与OA相关证型之间的关系，后续会增加体内动物实验，对比观察乌头汤对不同证型OA大鼠的治疗效果。

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收稿日期：2022-11-12；修回日期：2022-12-23