铁死亡在耳聋疾病中的研究进展*

柳铖棋 郑重 肖丽丽 夏俍 冯艳梅

耳聋的病因复杂,多种程序性细胞死亡均与耳聋的发生和发展有关,单一途径抑制某种程序性细胞死亡不能阻止耳聋的发生。铁死亡是一种新型程序性死亡,以铁积聚、脂质过氧化和损伤相关分子释放为特征,应激状态下多种抗氧化系统异常导致铁依赖的脂质过氧化是其主要的发生机制。铁死亡与多个系统的生理和病理过程有关,例如癌细胞微环境、神经退行性疾病、急性肾衰竭和心脏缺血/再灌注损伤。近年铁死亡也被证实存在于药物性聋的发生机制中,本文对铁死亡的基本分子机制和信号通路进行综述,概括其在临床疾病中的研究进展,并对耳聋与铁死亡相关的文献进行总结。

1 铁死亡概述

铁死亡的概念最早由Dixon等[1]于2012年提出,是一种以铁积聚、脂质过氧化和损伤相关分子释放为特征的新型的细胞死亡方式[2]。典型的坏死和凋亡的形态特征有细胞质和细胞器肿胀、细胞膜破裂、凋亡小体形成和细胞骨架解体[3],而铁死亡不具有上述特征,这可以把它与其他程序性死亡鉴别开。发生铁死亡的细胞不会皱缩或破裂,而是以线粒体的改变为主,表现为线粒体密度减小,线粒体膜密度增加,线粒体嵴减少或消失,但细胞膜保持完整,细胞核大小正常,染色质无凝聚[1];在生化上以铁代谢异常导致细胞内Fe2+堆积,细胞内脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成与降解平衡失调为特点。2018年国际细胞死亡命名委员会建议将铁死亡定义为由谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)调控的细胞内微环境氧化应激引发的、并且可被铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂抑制的调节性细胞死亡形式[4]。

2 铁死亡的关键环节

2.1铁死亡与谷胱甘肽代谢失衡 谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成,在体内以还原型和氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSH)两种形式存在,参与人体多种重要的代谢途径。在生理条件下,还原型GSH占绝大多数,故通常所指的GSH为还原型,在机体中主要发挥抗氧化作用。同时,GSH能抵抗氧化剂对巯基的破坏作用,在酶的活性、代谢、细胞保护等方面起直接或间接作用,被广泛用于肝病、肿瘤、中毒、白内障和衰老等疾病的治疗。

胱氨酸和谷氨酸通过胱氨酸/谷氨酸逆转运体(cystine/glutamate antiporter system,System Xc-)在细胞内外进行1∶1交换,胱氨酸在细胞内被转化为半胱氨酸,然后参与GSH合成。Xc-转运体是一种广泛分布于磷脂双分子层中的膜转运体,细胞依靠Xc-转运体调控GSH和GSSH的合成。Dixon等[1,5]通过实验证明对GSH合成的药理学抑制是诱导铁死亡的经典方法。当Xc-转运体被Erastin、索拉菲尼或柳氮磺胺吡啶等药物抑制时,可明显观察到细胞发生铁死亡,故上述药物也被认为是铁死亡的激活剂。通过改变细胞内外谷氨酸的浓度也可对细胞活性造成影响,当胞外谷氨酸浓度升高时,可观察到细胞发生铁死亡[1],反之,降低细胞外谷氨酸水平可适当保护细胞受到其他的毒性损伤[6]。

2.2铁死亡与ROS 细胞在代谢氧的过程中会产生ROS,ROS是未完全还原的含氧分子的总称,包括超氧化物(O2-)、过氧化物(H2O2和ROOH-)和自由基(HO-和RO-)[7]。在低水平下,ROS作为重要的信号分子参与了人体的自我修复,但在高水平下,ROS的异常积累与一些急性创伤和慢性退行性疾病有关[8]。

GSH作为一种细胞内必须的抗氧化剂,通过与GSSH的转换提供还原当量以消耗细胞内的活性氧,是细胞抗氧化系统中的重要部分。既往研究表明,抑制谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)从而降低GSH水平可选择性诱导细胞铁死亡的发生[9]。谷胱甘肽过氧化物酶根据氨基酸序列相似性可分为八种[10],其中,与其他家族成员不同,GPX4可以作为磷脂氢过氧化物酶将脂质过氧化物还原为脂醇,减少ROS堆积对细胞造成的损害,可有效抑制铁死亡的发生。故以GPX4为靶点,通过诱导GPX4失效可以引起膜脂上ROS积累,并造成铁死亡。

2.3铁死亡与铁代谢失衡 发生铁死亡的细胞内可观察到明显的铁离子堆积,这是现在确认发生铁死亡的方法之一。铁离子在细胞质内以一种动态铁库的方式存在,不停进行着铁的流入、储存、利用和排出的循环。生理条件下,转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)以内吞的方式摄入运载了Fe3+的铁蛋白,同时通过铁输出蛋白1(ferroportin 1,FPN1)外排。在细胞内铁与铁蛋白结合保存,如果铁蛋白含量减少,则铁会在细胞中形成不稳定铁池,而GSH被认为参与调控不稳定铁池,Fe2+与GSH的复合物被认为是不稳定铁池的主要形式[11],这也是GSH作为铁死亡关键因素之一的原因。在铁池中还存在游离的Fe2+以及不同类型的磷脂过氧化物,这些磷脂过氧化物在细胞内通过GPX4被代谢,而它的积累会导致铁依赖的脂质过氧化发生并导致铁死亡[12]。

2.4其他代谢途径 还有几种代谢途径可调节细胞对铁死亡的敏感性。铁死亡抑制蛋白1-辅酶Q10系统是首次被发现独立于GPX4调节铁死亡的酶催化系统,铁死亡抑制蛋白1 将细胞膜上的辅酶Q10还原,还原后的辅酶Q10能抑制过氧化反应并阻止铁死亡[13,14]。也可通过抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX),减少NOX的产生从而调节细胞对铁死亡的敏感性。几种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)循环中的抑制剂都可抑制细胞铁死亡的产生[15,16]。

3 铁死亡在临床疾病中的研究进展

既往研究发现铁死亡参与多种疾病的发生发展。铁死亡最早是在Erastin选择性杀死表达ras的癌细胞时发现的,后来Erastin被证明是通过抑制Xc-转运体激活铁死亡。此后,学者又在胰腺[17]、肠胃[18,19]、肝脏[20]等系统肿瘤中发现癌细胞的部分铁死亡靶点,这给肿瘤治疗提供了新的研究方向。

铁死亡在多种人体生理病理过程中存在。有研究报道铁死亡参与了神经退行性疾病、中风、脑外伤等的发生过程。Weiland等[21]在神经退行性疾病中观察到在中枢神经系统和/或外周神经系统的特定区域有大量的铁积聚,推测铁死亡参与神经退行性疾病的发生。Dietrich等(1988)在小鼠缺血性中风模型及脑损伤模型中发现神经元细胞中GSH水平显著降低,脂质过氧化程度增强。而使用铁抑制剂Fer-1可显著减少铁沉积、神经元变性和损伤,并显著改善其预后[22,23]。也有多篇文献报道了急性肾损伤模型中存在铁死亡相关改变。在GPX4基因敲除小鼠中,自发性急性肾损伤的发病率和死亡率显著增加[24],同样,在叶酸诱导的急性肾损伤小鼠模型中也证实了铁死亡是肾小管细胞的主要死亡形式[25]。此外,有研究报道铁死亡参与了心肌缺血/再灌注损伤的发病机制,心肌缺血再灌注过程中心肌细胞线粒体功能下降,从而导致钙处理中断和收缩功能障碍,进而引起心肌细胞发生铁死亡[26]。

4 铁死亡相关分子机制在耳聋疾病中的研究进展

铁死亡在2012年被提出后直至2020年才在耳科领域有相关研究,提示铁死亡与耳聋的发生发展有一定的关联。

4.1铁死亡在耳聋发生机制中的研究 耳蜗毛细胞系(HEI-OC1)是为数不多的用于研究的听觉细胞系之一,HEI-OC1细胞在耳蜗毛细胞内表达Prestin蛋白,这是外毛细胞的典型运动蛋白。因此,HEI-OC1细胞对于阐明这种重要听觉蛋白的新功能和作用机理非常有用。Chen[27]首先通过ras选择性致死剂3(ras-selective lethal 3,RSL3)诱导出HEI-OC1的铁死亡表现,包括在细胞中观察到二价铁离子的聚集与ROS水平上升。RSL3作为一种GPX4抑制剂,可以降低GPX4的表达,而Fer-1化合物可以有效抑制HEI-OC1的死亡。后续Jiang[28]和Zheng[29]则利用新霉素和顺铂的药物性聋模型成功在HEI-OC1中观察到铁死亡相同的细胞死亡形态,并且利用GPX-4保护剂类的铁死亡抑制剂可以有效降低药物导致的毛细胞损伤。推测毛细胞的损伤与GPX-4介导的谷胱甘肽代谢失调所致铁死亡有密切关联。而Chen[27]发现随着年龄增长,听觉皮层中的细胞出现与铁死亡相同的超微结构变化,推测铁死亡与年龄相关性听力损失的听觉皮层神经退行性变有关。

4.2GSH与GPX4在外周听觉中的相关研究 耳蜗的毛细胞中含有丰富的GSH,而其在基底膜中的浓度存在差异,自底回至顶回由低至高(Sha,2001),且在听力损伤中基底膜的损伤也存在差异,底回的损伤总是比顶回严重,推测GSH的含量差异在毛细胞的损伤机制中十分重要。谷氨酰半胱氨酸合成酶(glutamylcysteine synthetase,GCS)是GSH合成最后一步的关键酶。丁硫氨酸-亚砜胺(L-Buthionine-sulfoximine,BSO)作为GCS的抑制剂可有效抑制GSH生成,被认为是典型的GSH生成途径的铁死亡激动剂。Yamasoba等(1998)发现BSO可使动物的噪声易感性增加,表明抑制GSH可增加耳蜗对噪声损伤的敏感性,补充GSH可能通过提高半胱氨酸的利用率来减轻噪声引起的耳蜗损伤。而在传统的耳毒性模型(如卡铂、顺铂)中,均存在GSH的含量降低(Husain,2004)、ROS升高与铁离子浓度上升[29,30],因此铁死亡可能是耳聋的重要机制之一。并且之前的研究发现毛细胞中有丰富的GPX1与GPX4蛋白[31],推测在耳蜗中GPX蛋白起到了代谢氧化物的关键作用。而现有的铁死亡与耳聋相关药物性聋模型中,Zheng[29]与Mei等[30]学者也在小鼠基底膜的原代培养中验证了药物导致的铁死亡以及毛细胞丢失,证实在药物性聋中存在铁死亡的现象。

4.3氧化应激在耳聋中的相关研究 氧化应激一直被认为是感音神经性聋发病机制中的关键因素之一[32,33],而铁死亡的最典型病理生理机制为过氧化物堆积导致的细胞程序性死亡。在关于铁死亡的研究中,Chen[27]发现过氧化物在听觉皮层的累积与铁死亡相关联,并通过使用铁螯合剂去铁胺(deferoxamlne,DFO)减缓了铁死亡的过程。既往有研究认为NOX3(一种氮氧化物)在外毛细胞中尤其是耳蜗底回中的表达增加,直接参与了感音神经性聋的发展,而通过抑制NOX3有望预防感音神经性聋的发生。Du等[34]在研究中枢听觉通路时发现,使用NOX抑制剂Apocynin可在耳蜗核的腹核中发现神经元存活增加,进而避免老年性听力损失。在噪声性聋的NADPH代谢研究中,发现NADPH的过度激活会导致毛细胞的丢失[35]。并且有很多研究[36～38]都证实铁死亡的终产物丙二醇和4-羟基壬烯醛都在应激损伤的耳蜗细胞中增加。

4.4铁转运蛋白在耳聋中的相关研究 目前还没有文献证明铁转运通路导致的铁死亡参与耳聋的发展,但既往研究表明铁离子稳态可能与FPN1相关。Konrad-Martin等(2003)发现铁转运蛋白基因纯合基因型FPN1-8GG与突发性听力损失的风险呈显著正相关。Chen等[27]在对老年性聋的听觉皮层相关研究中观察到铁调节蛋白2(iron regulatory protein-2,IRP-2)上调,导致TFR1增加,而用DFO处理和敲除IRP-2可显著减轻模拟老化过程中的铁死亡。而另一项实验中,Peyvandi等[39]通过在噪声性聋模型大鼠耳蜗中移植间充质干细胞,发现DFO预处理可以显著提高间充质干细胞向损伤耳的归巢能力,从而减轻大鼠的听力损失。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)作为一种转录因子也参与了铁蛋白的调控,铁离子浓度上升可使HIF发生泛素降解,从而抑制铁离子调控相关基因的表达。有研究表明通过CoCl2处理,诱导HIF表达增加可以拮抗过氧化氢对细胞的损害,并对高频噪声性聋的小鼠有保护作用[40]。

5 小结与展望

迄今为止,铁死亡的研究尚在起步阶段,铁死亡的铁稳态与脂质过氧化的分子机制研究多集中于肿瘤领域。在耳科,关于铁死亡的研究相当有限,且多处于体外细胞实验阶段。但对比铁死亡相关分子机制和耳科学之前的生物研究可以发现,铁死亡的关键生化改变在耳聋的研究中有体现,提示深入研究铁死亡在耳科学中的相关机制也许能提供更多关于耳聋疾病(如药物性聋、噪声性聋或老年性聋)的治疗方向。