呼吸系统疾病中线粒体依赖型铁死亡机制的研究进展

陈少昀 马纯政 常思思 闫俊涛 高付彦 朱亚辉 李洪霖

铁死亡是一种铁依赖型、脂质过氧化物(lipid peroxides，LPO)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)堆积引起的氧化调节性细胞死亡，其特征是线粒体嵴减少或消失、线粒体外膜破裂和线粒体浓缩，这些现象可被铁螯合剂、抗氧化剂等所抑制[1]。脂质LPO主要由细胞代谢产生，因此细胞代谢在铁死亡中具有重要作用，越来越多的实验数据表明许多代谢途径，包括细胞呼吸[2]、脂质代谢[3]和氨基酸代谢[4]等都会促进细胞铁死亡。线粒体是细胞内代谢的主要场所和氧化应激的主要调节器[5]，是细胞内ROS产生的主要来源，所以在铁死亡过程中有较大的意义。最近的研究发现，铁死亡与许多呼吸系统的发生和发展密切相关，包括肺癌、急性肺损伤、肺缺血再灌注损伤、慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化等，线粒体作为细胞氧化代谢的中心，在呼吸系统疾病铁死亡的发生发展中也发挥着重要的作用。

一、铁死亡发生的机制

铁死亡最主要的特点是细胞内铁累积和脂质过氧化。铁的积累是铁死亡的开始，细胞内铁通过铁调节蛋白系统处于动态稳态中，铁调节蛋白系统可以感知细胞内游离Fe2+的浓度，它由转铁蛋白受体、二价金属离子转运蛋白-1、转铁蛋白和铁蛋白等组成。在正常生理条件下，膳食铁主要以Fe2+的形式被肠上皮细胞吸收，Fe3+与转铁蛋白结合后通过细胞膜上的转铁蛋白受体进入细胞。随后，细胞内的 Fe3+被前列腺六次跨膜上皮抗原3还原为 Fe2+，然后Fe2+通过二价金属离子转运蛋白-1释放到细胞质不稳定铁池中并储存在铁蛋白中[6]，铁蛋白是一种具有亚铁氧化物酶活性的贮铁蛋白，能将有毒的Fe2+转化为无毒的Fe3+，从而防止芬顿反应。这些相关蛋白的异常表达或功能障碍会导致细胞内铁离子浓度失衡，导致Fe2+积累，细胞内产生的过量Fe2+和过氧化氢发生芬顿反应并和铁依赖性氧化酶作用直接催化脂质ROS的产生，导致细胞内脂质ROS的不断积累并引发铁死亡。不受限制的脂质过氧化是铁死亡的标志性特征，多不饱和脂肪酸(Polyunstatured fatty acid，PUFA)是细胞膜脂质双层结构的重要组成部分，也是脂质过氧化反应的靶标。ROS是一类还原的含氧分子，包括过氧化物、超氧阴离子和自由基，它们对于维持细胞和组织的稳定状态至关重要，大多数与铁死亡相关的 ROS 源自芬顿反应，它们与脂质膜上的PUFA相互作用形成脂质 ROS，当大量脂质 ROS 在细胞中积聚时引起铁死亡[7]。在细胞内存在大量Fe2+的情况下，脂氧合酶(lipoxygenase，LOXs)通过催化PUFA氧化形成有毒的脂质自由基，参与铁依赖性脂质ROS的形成，最终导致细胞损伤[8]。同时，PUFA旁边的质子可以被这些有毒的脂质自由基转移，然后开始新一轮的脂质氧化反应，最终导致细胞发生更严重的氧化损伤。

二、线粒体在铁死亡中的作用

铁死亡时线粒体的形态往往发生显著的变化，在使用Erastin诱导细胞铁死亡时，可观察到细胞线粒体收缩、线粒体膜密度增加、体积减少和线粒体嵴消失等形态变化，同时还伴随着线粒体膜电位的超极化，这表明线粒体在铁死亡中扮演着重要的角色。线粒体是细胞内铁代谢的中心枢纽和ROS的主要产生者[9]。通过线粒体选择性荧光铁指示剂或电子磁共振对线粒体铁的评估表明，线粒体含有高表达细胞内铁总量20%～50%的铁[10]。有实验表明，ROS主要作为呼吸链反应的副产物在线粒体中产生，线粒体消耗的大约1%～5%的氧气转化为ROS，线粒体铁代谢和能量代谢都可产生ROS[11]。线粒体内铁代谢紊乱和能量代谢紊乱都可以导致细胞发生线粒体膜超极化、脂质过氧化物积累和铁死亡。

(一)线粒体中的铁代谢

线粒体内铁代谢失衡被认为与铁死亡相关，铁是线粒体内最常见的金属，积极参与线粒体的生理功能，但是过量的铁会通过限制线粒体的氧化磷酸化和抗氧化反应来损害线粒体的功能。线粒体中有几种调节铁稳态的分子，包括线粒体铁转运蛋白、电压依赖性阴离子通道(Voltage dependent anion selective channel，VDAC)和铁蛋白等。线粒体铁代谢主要发生在线粒体基质中，细胞中的铁必须穿过线粒体外膜和线粒体内膜进入线粒体基质，通过线粒体内膜的铁转运是一个活跃过程，依赖于膜铁转运蛋白1及其同系物膜铁转运蛋白2，二者失调会导致线粒体铁过载和氧化损伤[12]。线粒体和细胞质通过位于线粒体外膜的VDAC进行代谢物质的交换，VDAC可以调节线粒体的铁内流，VDAC水平增加会导致线粒体外膜渗透率提高，细胞质中的Fe2+向线粒体的内流增加，从而催化线粒体膜发生脂质过氧化反应，诱发铁死亡[13]。线粒体内含有一个不稳定的铁池，具有极强的氧化还原活性，在生理条件下，线粒体内的自由铁储存在线粒体铁蛋白中，并受线粒体铁蛋白的严格控制，该蛋白可以防止线粒体ROS的积累，下调该蛋白可以增加线粒体内游离铁的积累，导致线粒体氧化应激增加和功能障碍，产生更多的线粒体ROS并诱发铁死亡[14]。近年来研究发现铁硫蛋白(2Fe-2S)NEET在铁死亡中有重要作用[15]，铁硫蛋白在细胞质和线粒体之间调节硫离子和铁离子的输出，线粒体亚型铁硫结构域1是线粒体外膜上属于NEET家族的铁硫蛋白，是线粒体重要的应激反应蛋白，参与调节线粒体中铁和ROS的积累，它的缺失可导致线粒体内游离铁的积累和线粒体脂质LPO的发生，从而诱导铁死亡的发生[16]。

(二)线粒体中的能量代谢

线粒体能量代谢与铁死亡密切相关。在线粒体基质内发生的三羧酸循环(Tricrboxylic acid cycle，TCA)是细胞内重要的能量代谢和物质代谢过程[11]，同时也是细胞内ROS的主要产生场所。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是细胞内重要的抗氧化物，其合成受细胞膜上的胱氨酸谷氨酸转运受体systemXc-的影响，systemXc-是由SLCA711和SLC3A2组成的二聚体，可通过1:1的比例摄入胱氨酸并排出谷氨酸(Glutamate，Glu)，摄入细胞的胱氨酸有助于细胞合成GSH，当systemXc-失活后Glu无法释放到细胞外，并在谷氨酰胺合成酶的作用下转化为谷氨酰胺(Glutamine，Gln)，转氨酶通过转氨过程将Gln转化为α-酮戊二酸，从而为 TCA 循环和脂质生物合成提供燃料，使得TCA循环不断进行，产生更多的线粒体ROS[17]。研究发现，Gln分解产物α-酮戊二酸及TCA其他代谢物包括琥珀酸、延胡索酸和苹果酸等都是可以调节胱氨酸饥饿诱导的铁死亡，抑制TCA则可以减轻脂质ROS的积累和铁死亡的发生[18]。另外，TCA往往伴随着可促进线粒体氧化还原的电子传递链(The electron transport chain，ETC)过程，研究发现，胱氨酸饥饿诱导的铁死亡可通过抑制ETC线粒体复合物I、复合物Ⅱ、复合物Ⅲ和复合物Ⅳ得到减轻[19]。近来也有研究发现，能量应激介导的磷酸腺苷依赖的蛋白激酶活化可阻断铁死亡的发生，线粒体中的 ETC 可以驱动质子动力和三磷酸腺苷酶合成，从而抵消能量应激诱导的磷酸腺苷依赖的蛋白激酶活化，从而促进铁死亡[20]。此外，ETC 复合物I 和 Ⅲ 的电子泄漏会产生超氧化物，随后将其转化为过氧化氢，通过超氧化物歧化酶介导的歧化，过氧化氢可以与Fe2+反应生成羟基自由基，羟基自由基与PUFA发生氧化还原反应从而导致脂质体膜的过氧化[19]。这些都表明线粒体能量代谢在铁死亡中起着重要的作用，线粒体膜电位超极化、脂质LPO积累等铁死亡特征可以通过抑制线粒体TCA或ETC来逆转。

(三)线粒体的其他途径

铁死亡抑制蛋白 1(ferroptosis suppressor protein 1，FSP1)也可称线粒体凋亡因子诱导2，是另一种独立于谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)发挥作用的铁死亡抑制剂[21]。FSP1是位于质膜上的一种氧化还原酶，它将泛醌还原为泛醇，泛醌是一种亲脂性代谢物，是线粒体 ETC 中的关键电子传递载体，它的完全还原形式泛醇可以作为自由基捕获抗氧化剂来降解脂质过氧自由基的毒性，防止脂质过氧化反应的发生。因此，FSP1通过将泛醌还原为泛醇，减轻细胞内的脂质过氧化反应，抑制铁死亡的发生[22]。近来有最新的研究发现线粒体中的二氢乳清酸脱氢酶(Dihydroorotate Dehydrogenase，DHODH)可减轻线粒体内的脂质过氧化反应[23]，DHODH通过与泛醌发生氧化反应，催化二氢乳清酸分子转化为乳清酸并生成泛醇，从而修复线粒体膜脂质遭受的氧化损伤，这保护了细胞免受脂质过氧化和铁死亡的发生。此外，线粒体离子肽酶1(Lon peptidase 1，LONP1)是调节线粒体功能和维持线粒体基因组的完整性的主要多功能酶之一，在PANC1细胞系中，erastin诱导的铁死亡增强了线粒体LONP1的表达。相反，LONP1抑制导致NRF2/KEAP1信号通路的激活和GPX4的上调，从而减轻细胞内脂质过氧化反应的发生，抑制细胞铁死亡[24]。

三、肺疾病与线粒体铁死亡

(一)肺癌

肺癌是我国常见的恶性肿瘤，肺癌组织环境特殊，肺部与其他组织相比具有较高的氧水平，肺癌组织中的ROS水平和脂质氧化物水平与其他癌组织相比也较高，这表明肺癌中存在更多的铁死亡现象。肺癌中的铁代谢也与正常细胞有所不同，维持铁稳态的铁蛋白的表达显著升高，从而抵抗肺癌细胞中铁死亡的发生[25]。铁硫簇在电子转移和能量代谢中起着关键作用，铁硫簇合成的缺失会增加铁负荷并促进细胞发生铁死亡，肺中氧浓度比其他组织高得多，这会加快铁硫簇降解，因此肺癌细胞往往拥有高水平的铁硫簇生物合成酶。线粒体在铁硫簇的生物发生中起着核心作用，半胱氨酸脱硫酶(Nitrogen fixation 1，NFS1)是一种铁硫簇生物合成酶，它位于肺腺癌中存在的基因组扩增区域，在高分化腺癌中表达最高[26]。NFS1是线粒体铁硫簇组装机制的核心组成部分，胱氨酸是NFS1的合成底物，抑制systemXc-可以抑制NFS1的合成，同时也促进了Gln的分解，加速线粒体TCA循环，促进线粒体ROS的产生[27]。在肺癌组织的高氧环境下同时抑制NFS1与GSH的生物合成，将会导致肺癌细胞发生铁死亡，这表明了肺癌中的铁死亡与线粒体中的铁稳态失衡有密切关系。此外，研究表明，KRAS突变在人类肺癌中高度发生，从而提高了Gln分解，进入线粒体TCA循环的α-酮戊二酸增加，从而促进TCA循环的进行，加速线粒体ROS的产生[28]。另外，KRAS驱动的癌症中代谢途径也会发生不同的增强性改变，如Gln分解、糖酵解或营养吸收，从而影响TCA循环[29]。此外，还原性辅酶Ⅱ作为供氢体可参与体内多种代谢反应，包括维持线粒体TCA循环、脂肪酸合成和Gln代谢，并被谷胱甘肽还原酶用于将氧化型谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽，然而KRAS通过代谢重编程提高还原性辅酶Ⅱ的水平，这能提高GSH再生率并抑制铁死亡[30]。

(二)肺缺血再灌注损伤

肺缺血再灌注损伤(Lung ischemia-reperfusion injury，LIRI)是导致患者死亡的重要原因。LIRI会引起细胞氧化应激和炎症反应，并导致肺组织损伤的发展。线粒体功能障碍和ROS的过度产生介导了 LIRI 的发病机制[31]。在实验大鼠的LIRI模型中，存在线粒体氧化应激和形态损伤等铁死亡征象。有研究阐明，线粒体呼吸链功能障碍导致再灌注开始后ROS增加。ROS的产生可以攻击线粒体膜，引发脂质过氧化[32]。解偶联蛋白 2(Uncoupling protein2，UCP2)是一种位于线粒体上的阴离子载体蛋白，研究发现它可调节线粒体 ATP 和 ROS 的产生[33]，下调UCP2可致线粒体肿胀，线粒体嵴减少且变短。上调UCP2可减少线粒体中ROS的产生，从而减少LIRI 中铁死亡的发生，因此，可以通过靶向UCP2蛋白来保护肺缺血再灌注损伤，这为LIRI的治疗提供了新思路。

(三)慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统疾病中的常见病和多发病，并且是世界第四大死因。烟草烟雾是COPD 产生的主要风险因素，是由 6000 多种化学物质组成的混合物[34]。烟草烟雾中高浓度的ROS和亲脂成分能够通过细胞膜扩散至细胞内并损伤线粒体，同时可使肺部细胞的线粒体DNA含量下降，线粒体DNA的分子量和拷贝数对线粒体的TCA循环十分重要，香烟烟雾通过影响线粒体TCA循环诱导细胞发生铁死亡[35]。丙烯醛被认为是与吸烟相关的大部分非癌症疾病风险的原因。新的证据表明，丙烯醛诱导的气道上皮细胞线粒体形态和功能异常在 COPD 发病机制中起关键作用。近来有研究发现了丙烯醛对线粒体代谢途径关键成分丰度的影响，在暴露于一定剂量的丙烯醛后，线粒体内ETC复合物 Ⅲ 和 V 相关的核编码亚基的蛋白质丰度显著降低，导致线粒体障碍，且肺细胞中铁、血清铁蛋白和非血红素铁的浓度会增加，这都加快了肺上皮细胞的铁死亡进程[36]。先前也有研究表明，丙烯醛暴露会导致线粒体内ROS 含量增加，这会引起线粒体膜电位发生变化，线粒体膜通道开放，进而导致线粒体功能障碍，诱导细胞发生铁死亡。线粒体功能异常是COPD发生铁死亡的重要损伤机制，寻找高特异性的线粒体铁死亡抑制剂来控制COPD的发生发展是未来研究的关键。

(四)急性肺损伤

感染是急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)的主要致病因素之一。最近的研究表明，铁死亡在感染引起的ALI的发生发展中起重要作用。在脂多糖诱导的 ALI 小鼠模型中，ALI 小鼠支气管上皮细胞中游离铁的浓度显著增加[37]，而铁死亡标志物溶质载体家族7成员11(Recombinant solute carrier family 7，Member 11，SLC7A11)和 GPX4 的表达显著降低，导致细胞内Glu向胞外转出减少，细胞内Glu增多，Glu对线粒体TCA循环中的-酮戊二酸有促进作用，使得线粒体内TCA循环得以不断进行，导致线粒体膜电位超极化，线粒体内ROS堆积性增加，诱导支气管上皮细胞发生铁死亡，同时TCA循环可促进线粒体氧化还原的ETC，线粒体ETC复合物 I和Ⅲ的电子泄漏产生超氧化物，可促进PUFA过氧化，从而促进铁死亡。最新证据表明核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)抑制铁死亡并维持细胞氧化还原平衡[38]，Nrf2信号通路的抑制，会影响铁死亡相关蛋白如GPX4、SLC7A11等表达，导致线粒体内TCA循环加速进行，产生过量ROS，从而破坏细胞内氧化还原平衡，影响脂质过氧化诱发铁死亡。

(五)肺动脉高压

肺动脉高压(Pulmonary hypertension，PAH)是一种罕见的血管疾病，其特点是肺血管重构和肺血管阻力增加，最终导致右心衰竭和死亡。研究表明，铁代谢参与维持肺血管稳态，铁代谢失调在PAH的发展中起重要作用[39]。铁调素是铁代谢的调节因子，它可以与细胞质膜上的膜铁转运蛋白结合来抑制细胞内铁离子向细胞外转运，增加细胞内铁离子的浓度[40]，在PAH 患者，由于基因突变(如BMPR2 突变)和炎症反应等多种因素会导致铁调素异常升高，从而抑制肠道铁摄取和细胞内铁输出，导致细胞内铁积累[41]。细胞内铁积累通常会导致线粒体功能障碍，过量的铁转移至线粒体内，导致线粒体内发生芬顿反应，产生过量的线粒体ROS，引起线粒体内脂质过氧化、DNA 氧化等，从而影响线粒体的功能，进一步导致细胞产生氧化应激反应并发生铁死亡。

(六)新型冠状病毒肺炎

2019 年新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)在世界恶性传播，越来越多的证据表明COVID-19 患者疾病的加速进展与体内高炎症状态密切相关，并且这种升高的炎症反应会导致体内铁代谢失衡、氧化应激等[42]。能携带大量铁分子的铁蛋白和铁调素参与细胞内的铁代谢，COVID-19 感染可导致炎症状态，其中白介素-6可以刺激铁蛋白和铁调素的合成，从而阻止铁从细胞内流出，过量的铁可通过线粒体铁蛋白转移至线粒体内，导致线粒体内发生脂质过氧化反应并诱发细胞铁死亡[43]。此外，高炎环境会增加线粒体内的氧化应激反应[44]，炎症细胞因子如肿瘤坏死因子α诱导线粒体 ROS 的钙依赖性增加，干扰素-γ可上调诱导线粒体 ROS 产生的基因，白介素-6 和白介素-10 通过直接调节ETC的活性而调节线粒体 ROS 的产生，这些过量的炎症细胞因子促进了线粒体ROS的产生，加速了细胞铁死亡的发生。

(七)其他呼吸系统疾病

肺结核仍是严重危害人类健康的重大传染病，目前在世界范围内呈现恶化趋势。人体吸入结核杆菌后，肺泡中的巨噬细胞最先分泌大量的白介素-1、白介素-6 和肿瘤坏死因子，促使淋巴细胞和单核细胞聚集，形成联合肉芽肿以限制结核杆菌的扩散。研究发现，结核杆菌诱导的巨噬细胞死亡与 GSH 和 GPX4 水平降低以及游离铁、线粒体超氧化物和 LPO 增加有关[45]。另外，肺纤维化是一种致命的纤维性肺病，纤维化病灶的形成是一个突出的病理特征，由转化生长因子-β1诱导的上皮间质转化被认为与肺纤维化的发病机制有关，新出现的证据表明，转化生长因子β1促进A549细胞上皮间质转化过程中线粒体的超微结构变化，并观察到ROS增加的铁死亡迹象[46]。

四、线粒体铁死亡对呼吸系统疾病治疗的作用

线粒体在铁死亡中发挥巨大的作用，并且参与多种呼吸系统疾病的发生与发展，这为疾病的控制与治疗提供了一条新的思路。多项研究表明线粒体依赖型铁死亡在癌症治疗中有巨大的潜力。放射治疗是肺癌最常用的治疗方法之一，但是部分非小细胞肺癌患者会产生放射抗性，对放射疗法不敏感，新的研究发现，非编码小分子RNA(miRNA)可参与癌症的进展并调控癌症相关基因的表达，在有放射抗性的非小细胞肺癌中，非编码小分子RNA miRNA7-5p与细胞放射抗性之间存在密切关系，miRNA7-5p可使线粒体铁蛋白的表达降低，从而使得向线粒体内转运的Fe2+减少，降低线粒体内芬顿反应的发生，导致线粒体内ROS的产生减少，并抑制细胞铁死亡的发生，增强细胞对放疗的抵抗性[47]，因此对有放疗抗性的非小细胞肺癌患者，可采用控制miRNA7-5p表达的方法来减轻其放射抗性。阿霉素是一种广谱的抗肿瘤抗生素，常用于肺癌的化疗，研究证实阿霉素可以抑制肺癌细胞内线粒体 GPX4 的表达，使线粒体内发生脂质过氧化反应，诱导细胞发生铁死亡[48]。核蛋白转录因子1(nuclear protein transcription regulator 1，NUPR1)是一种小分子应激蛋白，NUPR1基因的失活会阻止非小细胞肺癌的增长[49]，最新研究发现NUPR1 抑制剂 ZZW-115 可诱导非小细胞肺癌中线粒体生物发生的关键基因发生变化和线粒体形态变化，导致线粒体内氧化反应增加产生过量ROS，最终细胞发生铁死亡，阻止非小细胞肺癌的发展[50]。此外，在脓毒症引起的肺损伤中，葛根素可降低损伤的肺泡上皮细胞中的铁水平和亚铁离子水平，并降低铁死亡相关蛋白的表达，从而起到缓解肺损伤的作用[51]，但是线粒体在其中的参与机制还尚不明确。总的来说，目前呼吸系统疾病中关于线粒体依赖型铁死亡的治疗研究还较少，并集中在肺癌的治疗方面，因此未来还需要不断发现探索在呼吸系统疾病中线粒体依赖型铁死亡的作用机制，为患者的治疗增加新的希望。

五、总结与展望

铁死亡参与了各种疾病的形态变化和病理过程。在肺癌、急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病中，对铁死亡网络的某一点进行干预可能对疾病的早期预防起到一定的作用，这有利于临床症状的改善并控制了病程的发展。尽管线粒体在氧化代谢中起中心作用，并在半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡中扮演主要角色，但是线粒体是否是铁死亡的重要组成部分仍然存在较大的争议，需要进一步的工作来挖掘铁死亡中线粒体的更多的作用和参与机制，这不仅可以促进我们对线粒体依赖型铁死亡机制的理解，还可以启发我们在疾病治疗中针对线粒体依赖型铁死亡探索的新治疗方法。此外，肺部与其他组织相比具有较高的氧水平，这种特殊的环境使得肺部细胞中可能存在较多的铁死亡，虽然目前已经发现了一些铁死亡抵抗机制参与了呼吸系统疾病的发生，但是呼吸系统疾病关于线粒体依赖型铁死亡的研究还较少，还是需要更多的实验来探索他们的发生机制，这也将会为呼吸系统疾病的治疗方面提供新的方向。