间充质干细胞及其外泌体治疗急性肺损伤的基础和临床研究进展

王晨 冯耘 时国朝

临床重症患者死亡的主要原因之一是急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，其中老年患者(年龄大于60岁)死亡率更高。目前，临床上急性肺损伤治疗方法多为传统的呼吸支持，不仅费用昂贵，还会严重损害患者的生活质量。近年来临床上一直在治疗策略上进行改进，但只能降低该病的死亡率，缺乏有效特异性治疗手段[1]。研究表明，细胞治疗具有免疫调节能力，抗炎能力等，其中间充质干细胞(MSCs)及其外泌体(MSCs-ev)因能缓解多器官疾病以及病毒引起肺部并发症而成为治疗ALI的备选治疗方案。

一、急性肺损伤(ALI)

急性肺损伤(ALI)主要由多发性外伤、失血性休克、严重烧伤等直接或间接引起，其中脓毒症和肺炎引起ALI的风险较高，临床具体表现为急性呼吸窘迫综合症(acuterespira-torydistresssyndrome，ARDS)。目前认为ALI/ARDS的本质为多种炎症细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞等)及其释放的炎症介质，细胞因子间接导致肺脏炎症反应。ALI/ARDS主要病理特征为肺微血管通透性增加，肺泡腔渗出液富含蛋白质，肺水肿等。

ALI/ARDS作为一种临床疾病，全身炎症反应(SIRS)与代偿性抗炎反应(CARS)失衡导致多器官功能障碍，伴随较高的死亡率。但ALI/ARDS的复杂病理生理学特点，提供了广泛的治疗靶点。ALI/ARDS的传统治疗方法有抗感染治疗、纠正缺氧、药物治疗等。

目前没有ALI/ARDS的专一性药物[2-3]，但仍有一些药物因其特性被列入备选。糖皮质激素通过抑制促炎因子的生成与释放，改善脱离机械通气时间，呼吸顺应性以及氧合作用；表面活性剂通过维持肺泡开启与促进气体交换，改善氧合，缩短机械通气时间；抗氧化剂通过清除肺组织中多余的氧自由基，改善患者血氧饱和度和氧分压；非甾体类药物通过使血小板凝结，发挥抗炎作用，减少肺泡灌洗液中蛋白质，白细胞含量；血管扩张剂通过改善组织供氧，降低肺动脉高压，改善氧合；除此之外西维来司他钠被用于ALI治疗[1,4-5]。需要注意的是，这些药物的使用需要考虑病人实际情况。另外根据临床上潮气量(VT)、氧合指数(PaO2/FiO2)、呼吸频率(RR)等参数做出具体的呼吸支持策略，如机械通气、体外膜肺氧合等。给予呼吸支持，虽然可快速改善患者低氧血症和高碳酸症，但仍要考虑呼吸支持带来的并发症，如气胸、肺不张、人-机对抗等。ALI/ARDS的治疗，目前尚未有特异有效的治疗方法。细胞治疗因其多能性和可溶性生物活性因子的释放等特性被认为是一种潜在的治疗手段。

二、间充质干细胞(MSCs)

细胞治疗中，MSCs因其多谱系分化能力，调节炎症的能力，调控免疫的能力而备受关注。

(一)MSCs 基本信息

MSCs作为重要的多能非造血干细胞之一，最早于1968年由弗里登斯坦及其同事在骨髓中提取出来，此后开始对MSCs长达半个世纪的探索，于2006年国际细胞治疗学会对间充质干细胞做出具体最小标准：(1)在标准组织培养条件下，该细胞可贴壁生长。(2)在标准组织培养条件下，该细胞可分泌CD105、CD73和CD90等表面标记物，不可分泌CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79和CD19等细胞标记物。(3)在特殊组织培养条件下，该细胞可分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。

(二)MSCs治疗ALI/ARDS的潜能

间充质干细胞自身潜能具有多样性，因此在急性肺损伤治疗过程中的受体细胞也具有多样性。例如：间充质干细胞在趋化因子的作用下与血管内皮细胞相互作用；间充质干细胞在线粒体、生物活性因子、凋亡基因等作用下与肺泡上皮细胞相互作用，另外间充质干细胞与免疫细胞之间的作用更为复杂。

1 间充质干细胞(MSCs)的迁移和归巢

MSCs可以在趋化因子的协助下完成迁移与归巢。间充质干细胞(MSCs)可以分泌趋化因子受体如：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8等，识别趋化因子，诱导MSCs向炎症或损伤部位移动,并在粘附分子与受损部位内皮血细胞相互作用使MSCs定向移动，完成归巢。值得注意的是，肺是间充质干细胞归巢的主要器官或组织，在多器官损伤的功能障碍发展中，MSCs也会出现在不同的部位。另外，在MSCs治疗ALI中，SDF-1/CXCR4轴具有关键作用。

2 间充质干细胞(MSCs)的免疫调节能力

MSCs参与免疫调节一般是促进免疫细胞向抗炎表型转化。首先，MSCs具有低免疫原性：由于间充质干细胞仅表达相容性复合物Ⅰ类分子，可逃避CD4细胞的免疫识别，避免自然杀伤细胞的攻击[6]。其次，MSCs通过抑制先天或适应性免疫活性实现其免疫调节能力。MSCs通过释放可溶性因子如TLRs、TGF-β、PGE-2、IL-10实现免疫抑制。另外MSCs在炎症微环境作用下，使M1型巨噬细胞(促炎)转变为M2型巨噬细胞(抗炎)，增加吞噬细胞的活性[6]。此外MSCs使Th1细胞的促炎症反应转向Th2细胞的抗炎症反应，分泌可溶性抗炎因子同时抑制促炎因子分泌[7]，如在脂多糖诱导的大鼠模型的ALI中，在间充质干细胞作用下，促炎因子TNF-a、IL-1b和IL-6等表达量降低，抗炎因子IL-10的表达量上升。与传统的免疫抑制相比，MSCs对免疫系统的影响更为复杂。

另外MSCs还具有抗菌、抗病毒性。MSCs分泌的抗菌肽[8]同时具有抗菌性和抗病毒性。如LL-37对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有抗菌性和抗病毒性，另外，MSCs表达的干扰素刺激基因(LGS)对登革热病毒、埃博拉病毒等病毒有抗性。

3 间充质干细胞(MSCs)的组织修复与再生

每一个MSCs都具有分化成多个不同组织或器官的潜能。MSCs的组织修复与再生功能是一个复合过程，与MSCs的归巢与迁移、免疫调节相关。MSCs对肺修复性治疗被认为是由一种KGF依赖的旁分泌机制产生的分泌产物发挥作用[9]。在ALI/ARDS发展的同时，MSCs分泌具有大量旁分泌作用的细胞因子(ANG-1、HGF、EGF、KGF)，改变细胞外基质(ECM)的产生和重塑，另外，MSCs可直接分化成肺泡上皮细胞，取代受损细胞[3,10-11]。

4 间充质干细胞(MSCs)线粒体转移

MSCs线粒体转移通常借助微囊泡的作用。微囊泡包裹线粒体，从间充质干细胞表面脱落或胞吐作用释放，微囊泡被肺上皮细胞吞噬后，线粒体转移进入肺泡上皮细胞，使上皮细胞的ATP的含量升高，从而恢复肺泡上皮细胞生物功能。另外，线粒体转移至吞噬细胞，可增强吞噬细胞的吞噬活性，增强抗菌性[12]。另有研究查明，线粒体转移进入受损细胞，可减少由线粒体功能障碍导致的炎症[13]。

5 其他

ALI/ARDS患者由于肺泡毛细血管屏障被破坏，Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡等原因，使间质肺泡中含蛋白质的水肿液增加。MSCs通过分泌大量生长因子(KGF、HGF、ANG-1)预防和治疗肺水肿。另外，MSCs通过迁移和归巢，进入肺损伤组织，发挥修复作用，改善弥漫性肺水肿。MSCs也可以通过分泌生物活性因子，上调抗凋亡基因，下调抗凋亡基因，以及转移线粒体的方式减少Ⅱ型肺泡上皮细胞的凋亡[3]。冯耘团队研究表明脂多糖(LPS)能减少间充质干细胞生物活性因子的分泌，如Ang-1、SPC、FGF-10等，利拉鲁肽可通过GLP-1R/PKAc/β-catenin信号通路增强SPC、Ang-1和FGF-10的表达，逆转脂多糖对间充质干细胞的作用，增加MSCs分泌功能[14]。另有研究表明MSCs可与利拉鲁肽协同作用，减少MSCs细胞凋亡。

ALI/ARDS进入第三阶段后，肺纤维化迅速发展并致密。肺纤维化主要由ECM蛋白异常表达，过度沉积，使肺组织失去再生功能[15]。MSCs通过分泌可溶性因子MMP-1等阻断TGF-β/Smad通路，减少纤维化[16]。另外，有研究表明MSCs治疗肺纤维化效果更优于抗纤维化药物[17]。

(三)MSCs治疗ALI/ARDS的临床现状

1995年，第一次将MSCs应用于临床试验中，随后的一个世纪，探索了MSCs在多种临床疾病的应用，且已经证明了MSCs的安全性[18]。MSCs治疗ALI/ARDS在不同原因导致的肺炎(脂多糖LPB、大肠杆菌等)时，不同给药方式(静脉注射、气管内注射等)及不同剂量产生的治疗效果[3]。多个团队进行了临床试验，结果表明MSCs临床治疗ALI/ARDS能改善氧合，并且无不良反应，其中MSCs注射最大剂量为100万细胞/kg[19-20]。

另有研究表明：(1)骨髓来源的MSCs能通过分泌高抗炎因子IL-10等减少肺部炎症，降低细菌负荷，减少肺损伤，减弱肺水肿，增强肺上皮创面的修复[3,21-22]。(2)MSCs治疗支气管发育不良[23]，特发性肺纤维化[24]等肺部疾病均安全。(3)尽管MSCs会因为分泌先天促凝活性因子而增加静脉注射时血栓栓塞的风险，但静脉注射可能是目前细胞治疗急性肺损伤的最优方式[21]。静脉注射给药通过参与循化以及自身的归巢作用，作用于受损器官。

MSCs可以通过减少炎性介质过度表达、白细胞浸润、组织损伤，已经缓解肺功能衰竭等治疗ALI/ARDS，并越来越受关注。但MSCs仍然具有现阶段需要解决的问题。首先间充质干细胞在高炎症等恶劣环境中高度敏感，其次间充质干细胞分泌的某些潜在细胞因子，如VEGF。另外，间充质干细胞在体内的增殖是不受控制的，有成瘤的风险。最后，值得注意的是，MSCs的运用属于活细胞运用，对MSCs的保存与运输均有特殊要求[25]。总之，作为治疗急性肺损伤的方案之一，MSCs还需要解决间充质干细胞自身稳定性等问题。

三、间充质干细胞外泌体(MSCs-ev)

由于MSCs不可避免的会产生致瘤等风险，MSCs-ev因其低致瘤性，易操作，可用性强等优点，使MSCs-ev治疗成为了一种有前途的策略。

(一)基本信息

目前研究表明：MSCs通过分泌可溶性营养因子发挥治疗作用，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞外囊泡等，这些因子被统称为分泌组。分泌组产生的途径一般为经典和非经典途径。经典途径指内质网-高尔基体参与的胞吐作用；非经典途径是信号肽介导的细胞选择性释放过程。其中，细胞外囊泡作为磷脂双分子囊泡，包裹蛋白质，脂质，核酸等生物活性不受影响[21]。因包裹内容物种类与含量决定了细胞外囊泡的功能效应，所以确定胞外囊泡的特征至关重要。

2013年，通过发生过程，大小以及生物学功能等，将胞外囊泡基本分为外泌体、微囊泡、凋亡小体三种[25]，与2018年，国际细胞外囊泡学会召开会议，对胞外囊泡的特征达成共识：1)通过包括蛋白质，脂质或RNA在内的含量分析，分析胞外囊泡的大小；2)通过蛋白质免疫印迹法或PCR技术，分析胞外囊泡的蛋白组成；3)通过可视化技术分析单囊泡分析；4)通过拓扑分析，分析胞外囊泡的相关组件[26]。

(二)间充质干细胞外泌体(MSCs-ev)与间充质干细胞(MSCs)的区别

外泌体(EV)的生物学功能由包裹的蛋白质、mRNA、miRNA决定。MSCs-ev同样具有调节免疫系统，参与组织修复的作用。另外，EV作为细胞主动向外界分泌的细胞产物，可突破血脑屏障等一类阻碍，在体内循环的作用下，运输到靶细胞，完成信息传递的基本功能。

有研究表明MSCs-ev通过转移miR-145的方式，调控多药耐药相关蛋白MRP1(Multidrug-resistance associated protein 1，MRP1)，增加MRP1 mRNA降解，白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)表达水平升高，并通过LTB4/BLT1信号通路增加抗菌活性，并且LTB4与抗菌肽LL-37以协同作用的方式抑制炎症，增加抗菌。另外miR-145的转移使抑制基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)降解增加，细胞外LTA4水解酶(LTA4 hydrolase，LTA4H)水平增加，降解PGP促进炎症消退[27]。除介导微RNA的方式外，MSCs-e在ALI/ARDS中对肺的保护作用中，还具有别的方式。研究表明MSCs-ev能降低核因子κB(NF-κB)与丝裂原活化蛋白激酶(MAKPs)的过度活化，减少巨噬细胞产生促炎因子，依赖TLR4/NF-κB信号通路实现对肺保护。在呼吸机性肺损伤的治疗中，MSCs-ev抑制了机械敏感钙通道(TRPV4)激活，阻止Ca2+内流，减少由高潮气量通气引起的肺血管通透性增加和促炎因子对的释放[28-30]。另研究表明MSCs-ev通过提高肺组织细胞中线粒体自噬水平改善肺血管内皮细胞功能和肺血管内皮通透性。具体机制如下：激活凋亡诱导因子AIF，线粒体自噬相关蛋白Pink1/Parkin蛋白表达增高，肺组织自噬相关蛋白LC3A/B、beclin-1表达升高，炎症因子TNF-α 表达降低，细胞粘附连接主要成分E-cadherin 蛋白表达升高[31]。还有研究表明MSCs-Exo通过抑制caspase-1的活性抑制肺泡巨噬细胞AMs焦亡减轻ALI。具体机制为：MSCs-Exo抑制caspase-1活性，阻止caspase-1发挥切割作用。AMs焦亡减少，巨噬细胞焦亡相关蛋白表达受抑制，如：NLRP3、GSDMD、IL-1β等，LDH，IL-18炎症因子水平降低[32]。

相比于完整的细胞相比，MSCs-ev没有自我复制能力，不会造成医源性肿瘤。另外，保存方面，间充质干细胞更为苛刻，MSCs-ev可以保存在-80°但不需要二甲基亚砜DMSO的加入，更好的保护MSCs-ev的生物活性。另外，MSCs-ev不含有MHC抗原，异体免疫排斥风险低，提高体内的保存及稳定性。最后，相比于间充质干细胞，MSCs-ev是包裹着miRNA、mRNA、脂质、蛋白质、甚至是细胞器的囊泡，可通过血脑屏障[2]。总之，MSCs-ev因其自身特性，逐渐在被异体移植，再生医学等领域重视。

(三)MSCs-ev治疗ALI/ARDS的临床现状

ALI/ARDS总是在临床上出现多器官功能衰竭症状，一般都是由线粒体功能障碍引起[2]，而MSCs-ev可以包裹具有功能活性的线粒体并发生线粒体转移[2,21]，另外加上MSCs在临床应用的弊端[33]，使MSCs-ev的研究与应用逐渐走入大众视线。研究表明：MSCs-ev抑制丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，使急性肺损伤小鼠模型的血清中的炎症因子减少。如IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α等。另外MSCs-ev miR-146a使巨噬细胞由M1型转化为M2型，从而减轻肺水肿与炎性细胞浸润。除了急性肺损伤，MSCs-ev还可以对其他肺部疾病有治疗效果。如肺动脉高压、肺癌[34]等。

MSCs-ev治疗急性肺损伤的研究大多进行到临床前试验动物阶段。2020年，在由COVID-19引起的继发性急性肺损伤中，有24例患者单次静脉注射间MSCs-ev，患者耐受性良好，MSCs-ev通过下调患者以内细胞因子风暴，参与免疫系统从建改善患者氧合及临床症状[35]。

四、问题与展望

细胞治疗作为新兴的用于ALI/ARDS的治疗手段，想要被临床认可，除了以上提出的MSCs能调节免疫过程、抗炎、抗病毒、参与组织修复等特性外，还需要解决的问题有：1)MSCs的稳定，包括来源稳定，培养过程稳定、体内定向转移与增殖稳定。2)MSCs的运输。除此之外，虽然MSCs治疗急性肺损伤的临床试验已经进行到Ⅱ期，但仍然无法确认具体剂量。

MSCs属于异质性细胞，通过分泌活性因子发挥作用，EV为MSCs的分泌组，由其包裹的蛋白质及miRNA的种类及含量决定功能。由此，MSCs-ev用于治疗急性肺损伤首先需要解决的就是MSCs-ev标准化问题。另外，MSCs由于提取方式不统一，无法满足稳定大规模生产。

急性肺损伤的发病率与死亡率一直居高不下，急需寻找一种安全有效的治疗方法。细胞治疗因可针对性缓解急性肺损伤生理病理学特定，而被纳入治疗备选。了解MSCs具体的分泌机制有利于临床试验对间充质干细胞的应用，另外我们仍需要进一步探索MSCs产生EV的具体机制以及MSCs-ev富集蛋白质与miRNA的机制。这对细胞治疗法治疗急性肺损伤至关重要。