间充质干细胞及其来源外泌体治疗急性呼吸窘迫综合征后肺纤维化的研究进展

刘树安 王凯 叶梦杰 张敬浩 李轲 刘媛媛 经慧 武焱旻

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是继发于呼吸道或全身炎症反应引起的氧疗难以纠正的快速进展的呼吸困难及难治的低氧血症，是临床上常见的危重症疾病之一。其病理改变主要表现为：肺泡上皮及肺血管内皮损伤合并毛细血管通透性增大，胶原蛋白大量积聚、炎症介质过度释放所致肺水肿及肺纤维化的形成。ARDS病死率较高，也是目前波及全球的新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者死亡原因之一，在一项统计分析中显示COVID-19重症患者死亡率为61.5%，在此之中有81%发生过ARDS[1]。研究指出，ARDS早期病程中就会出现胶原沉积、促纤维化生成因子水平增加，以及成纤维细胞迁移及增殖[2]。肺纤维化贯穿整个ARDS发展过程，其严重程度拟称为地震后的海啸，是导致ARDS病死率居高不下的重要原因之一[3]。在其发病机制的研究中，炎症反应失控和 肺毛细血管屏障(PACB)功能障碍是重要因素[4]。炎症反应失控加剧肺泡上皮细胞弥漫性损伤，使之原有结构破坏，通透性增加，进而导致炎性介质、细胞因子、趋化因子及促纤维化因子等各种因素攻击受损的上皮细胞，经转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)及下游Smad2/3的活化引起上皮间质转化，促进肺泡结构异常修复，导致肺纤维化[5-6]。在一项COVID-19所致ARDS治疗的调查中显示，即便是安全度过急性期的患者很大一部分也会死于随后的进行性肺纤维化[7]。因此，纠正ARDS后肺纤维化是ARDS治疗的重点之一[8]。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来源于多部位的成体干细胞，因其具有自我更新、自动归巢及分化、促进组织修复、旁分泌等特点而广泛用于再生医学领域[9]。许多研究者请求投放到呼吸系统疾病的治疗中，并在相关LPS、博来霉素等诱导的急性肺损伤模型及COVID-19、肺纤维化等疾病治疗中取得成果[10-13]。MSCs来源外泌体(MSC-Exo)是MSCs旁分泌胞外囊泡(extracelluar vesicles，EV)中的一种，含脂质双分子层结构，直径大约30～100nm，其含母体细胞相关的核酸(miRNA等)、蛋白质等，可以维持母细胞的功能表型，具有与MSCs相同的疗效，且性质更趋稳定，是维持细胞间通讯方式和生物活性物质转运的载体[14]。针对临床疾病的治疗，相比于直接应用间充质细胞，无细胞结构的外泌体可以避免自我复制，降低医源性肿瘤的发生，并且其储备更经济方便，临床应用更安全，甚至治疗效益更强[15]。因此，我们对MSCs及MSC-Exo治疗ARDS后纤维化的研究进展展开综述，以便为基础研究及未来的临床应用提供一定的借鉴意义。

一、MSCs治疗ARDS后肺纤维化潜在机制的研究进展

MSCs是目前研究最广泛的成体干细胞，因其具有强大的分化潜能，免疫源性低且易于提取等优势，活跃在干细胞治疗的领域中。针对MSCs治疗ARDS后肺纤维化的临床研究不断开展，大量实验结果证实其治疗肺纤维化的有效性[16]。现相关Ⅱ a期临床试验报道也证明其安全性[17]。目前也被认为是治疗COVID-19最有潜力的细胞治疗方式[13]。针对MSCs治疗ARDS后肺纤维化的作用，目前大部分学者的观点是其主要通过自动归巢和分化及自分泌和旁分泌来发挥作用。

(一)通过自动归巢及分化特性

自动归巢特性是MSCs治疗ARDS后肺纤维化的机制之一。有研究显示，外源性MSCs可归巢到受损伤的肺组织，变成肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell，ATⅡ)，修复损伤的肺泡上皮及血管内皮细胞结构，降低通透性，减轻渗出及肺水肿[18]。MSCs干预治疗可激活Wnt/β-catenin信号通路，并增加在受损肺组织的滞留时间，促进MSCs向ATⅡ充分分化，使ARDS模型鼠的肺损伤得到显著缓解，印证MSCs治疗ARDS的机制与其归巢及分化特性相关[19]。对此Jiang等[20]将骨髓间充质干细胞(BMSCs)与ATⅡ共培养后，发现 BMSCs 主要分化为ATⅡ细胞。另有研究证明通过敲除基因LATS2，抑制Hippo信号通路，从而能提高MSCs在ARDS模型小鼠肺组织内的存留及向AT Ⅱ细胞分化调控肺内炎症反应，减轻肺损伤及肺纤维化改变[21]。此外，MSCs还可以向损伤的肺泡上皮细胞迁移线粒体以及胞质信息促进上皮组织损伤的修复。Zhou等[22]将BMSCs与LPS诱导后的RAW264.7细胞共培养，运用Transwell 法证实其通过线粒体迁移抑制巨噬细胞凋亡，抑制急性肺损伤。但是，有些研究指出单纯的MSCs植入后在肺内定植量并不高，认为其治疗作用并非得益于其分化作用[23-24]，因此，鉴于MSCs治疗ARDS后肺纤维化是否通过自动归巢及分化机制尚有争议，仍需进一步研究及验证。

(二)通过旁分泌途径机制

旁分泌多种细胞因子是MSCs发挥作用的又一机制，其旁分泌因子参与调控炎症反应、调节免疫、血管生成、抗纤维化、抗菌和促进结构修复等特性，从而促进组织的恢复和再生[25]。1)MSCs可以通过调控炎症因子及抗炎因子的活性和比例来调控炎症反应，在Hayes 等[26]研究的人源MSCs干预呼吸机相关肺损伤模型鼠的实验中显示：人源MSCs通过提高角质细胞生长因子(KGF)的浓度，同时减少肺损伤炎性反应诱导产生的中性粒细胞趋化因子-1 和白细胞介素-6来调节炎症反应，减轻肺损伤。另有研究显示向LPS诱导的ARDS后纤维化模型鼠气管中注射人脂肪MSCs(AD-MSCs)可以通过减少中性粒细胞浸润改善肺损伤[27]。2)MSCs可调控巨噬细胞极化，进而调控肺组织修复。巨噬细胞是参与肺损伤的重要炎症细胞，其调控组织异常修复，通过促进肺组织间质细胞增殖，细胞外基质过度沉积致肺纤维灶形成。M1型巨噬细胞参与ARDS急性期，发挥吞噬作用介导肺内炎症反应。稳定期时，其向M2型极化，分泌抗炎因子(IL-4、IL-10等)，抑制促炎细胞因子(IL-1β、IFN-α、NO等)产生。但与此同时，过多的M2型极化促进细胞增殖反应及胶原积聚[28-29]。研究者共培养MSCs和未极化的巨噬细胞后发现，共培养后细胞表面持续高表达抗炎因子IL-10等，低表达抑炎因子INF-α等，从而证明MSCs能够调控巨噬细胞极化，进而调控组织的修复作用。在Chu等[30]研究者的研究中，向博来霉素诱导的ARDS后肺纤维化模型鼠静脉注射人脐带MSCs(HUMSCs)，发现其可提高巨噬细胞基质金属肽酶 9(MMP-9)的表达，促进胶原蛋白降解，并促进肺中 toll 样受体 4(TLR-4)表达以促进肺泡再生，减轻肺部炎症及上皮间质转化程度。他们还将HUMSCs与受损伤肺上皮细胞共培养，发现提高了肺巨噬细胞中的 MMP-9 水平，从而促进组织修复。3)MSCs调控树突细胞分化为调节性树突细胞，通过免疫调节调控炎症反应[31]。树突细胞是机体内重要的抗原提呈细胞，免疫调控的桥梁。树突细胞分为未成熟树突细胞及成熟树突细胞，成熟树突细胞可通过抗原提呈激活T细胞，从而诱导免疫应答。ARDS时成熟树突细胞明显增加，并可通过增强辅助性T细胞I(Th1)型免疫反应，分泌促炎性细胞因子，加重肺部炎症反应[32]。有研究证实，骨髓来源的MSCs可使成熟树突细胞分化为低表达CD1a、CD80、CD86、CD40及高表达CD11b的调节性树突细胞，促进调节性T细胞产生并进行免疫调节，从而减轻ARDS肺组织损伤[33]。更需关注的是，在新冠肺炎治疗极度棘手期间，数例应用MSCs治疗的临床报道得出MSCs疗法通过其免疫调节特性抑制过度激活的免疫系统，并促进感染患者肺微环境中肺泡细胞的组织修复，是理想的治疗候选者[34-36]。4)MSCs可直接分泌多种生长因子，如KGF、血管内皮生长因子(VEGF)等，参与调控体液平衡及增加对肺损伤的治疗效果。其中，MSCs分泌的KGF可以提高ATⅡ 钠泵的表达，调控肺内渗透压，缓解肺水肿[37]。有研究用慢病毒转染法敲低了MSCs中的VEGF基因，通过尾静脉向脂多糖诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠注射MSCs，数据显示，MSC 中 VEGF 基因敲低导致受伤肺中 VEGF 表达相对不足，并显著降低 MSC 对急性肺损伤的治疗作用，因此得出 MSC 的 VEGF 表达特征在 MSC 的治疗作用中起积极作用[38]。5)MSCs通过旁分泌抗菌肽参与抗菌调节。有研究将脐带间充质干细胞(HUMSCs)与耐药亚胺培南的抗菌株共培养，发现其可抑制抗菌株的生长，并证实其抑制机制是通过HUMSCs旁分泌抗菌肽LL-37等因子参与调控细菌生长并增强抗生素抗菌作用[39]。这也意味着MSCs的旁分泌调节在细菌肺炎、脓毒血症等引起的ARDS中的治疗潜力。

二、MSC-Exo的优势及治疗ARDS后肺纤维化的机制

随着MSCs在临床治疗的开展，MSCs治疗的局限性也逐渐展现，相关研究已证实，BMSCs在低浓度的IFN-λ刺激下可成为抗原提呈细胞，表达MHC Ⅱ类抗原，已有证明这与其他因素(如低水平的TGF-β等)一起诱发免疫反应，从而引起某些小鼠模型中的BMSCs被排斥，这暗示了BMSCs在患者体内引发免疫反应的可能性，可能会加剧ARDS的进展[40]。其次，MSCs的冷冻保存需要二甲基亚砜等防腐剂，这一定程度上干扰了MSCs的活性。相对于此，MSC-Exo优势突出，其无细胞，不具备自我复制能力，无分化肿瘤细胞风险。其次，其发挥作用不产生MHCⅡ，因此不会激发机体免疫排斥，在冻存上，其不需要二甲基亚砜等防腐剂，避免活性干扰。除此之外，MSC-Exo相对于MSCs体积小，更易于通过毛细血管迁移至受损靶器官[41]，是MSCs无细胞替代的首选[42]。

最近的研究表明，MSCs对疾病的治疗潜力依赖于它的细胞外囊泡，最主要的是外泌体[29, 43]。ISEV将其分为三种亚型，包括凋亡小体、微泡和外泌体，其中外泌体体积最小，直径50～150nm，稳定性最好[44]。机体内几乎所有细胞都可以分泌外泌体，不过，MSCs分泌外泌体的能力最强，MSC-Exo通过内吞胞膜、质膜融合、释放至胞外环境三阶段产生，内含MSCs来源相关的蛋白质、核酸及脂质等遗传信息，参与细胞间信号传递[45]。MSC-Exo可以应用于ARDS后肺纤维化的治疗在LPS及博来霉素、大肠杆菌等干预的ARDS后肺纤维化模型中取得成果，但目前尚无相关临床研究报道。对于其治疗ARDS后肺纤维化的机制也在不断的研究当中。现有的研究支持MSC-Exo与MSCs具有同等功效，可通过抗炎、免疫调节、抑制上皮间质转化等机制参与ARDS后肺纤维化的治疗中，并且MSC-Exo 可通过内含的核酸等信息参与逆转肺纤维化。

(一)通过抗炎、免疫、巨噬细胞表型调节参与上皮间质转化，逆转肺纤维化

1)通过调控炎症因子水平。Li等人[46]将MSC-Exo尾静脉注入内毒素诱导的ARDS模型小鼠体内，对比对照组，MSC-Exo可显著降低ARDS模型鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平。Deng等人[47]将不同来源的间充质干细胞源外泌体对脓毒血症所致ARDS模型鼠治疗效果分析显示，其均对ARDS的炎症反应有抑制疗效，并对肺组织的病理变化有明显改善，此项研究提出脂肪来源间充质干细胞源外泌体效果更佳。另已有研究明确外泌体的抗炎、免疫调节等特性是其发挥作用的关键[48]。2)通过调节巨噬细胞表型，调控肺泡上皮细胞凋亡。Mansouri等[49]用BMSC-Exo干预博来霉素诱导的肺纤维化模型，证实其可通过调节巨噬细胞表型预防或逆转模型鼠肺纤维化程度。高等研究者[50]以脂肪间充质干细胞来源的外泌体(ADSCs-Exo)作为干预手段，评估了其对 PM2.5 引起的肺损伤及肺纤维化的保护作用和机制，证明其治疗减少了 PM2.5 诱导的 Ⅱ 型肺泡上皮细胞凋亡和坏死，减轻肺泡上皮损伤及肺纤维化的发生。与此同时，其逆转ARDS后肺纤维的机制在不停地研究中。3)通过炎症相关通路抑制上皮间质转化。杨静等[51]通过向博来霉素诱导的肺纤维化模型鼠注射人脐带间充质干细胞源外泌体(hUCMSC-EXO)进行干预，得出hUCMSC-EXO可经阻断TGF-β1/Smad2/3信号通路激活，抑制上皮间质转化，缓解小鼠肺纤维化程度，并在细胞实验中验证了此项结论。4)通过免疫调节。Kaspi等[52]从诱导高分泌神经营养因子及免疫调节因子的间充质干细胞中分离外泌体干预LPS诱导的ARDS小鼠模型，相较于基本外泌体来说取得了更优的效果，并指出这也可能成为新冠治疗的有效手段。

(二)miRNA参与调控ARDS后上皮间质转化

MSC-Exo中的核酸等信息是区别于MSCs胞外囊泡中的重要物质，其中miRNA是参与细胞间信号传导的主要物质[53]。有研究将MSC-Exo与内毒素处理的MLE-12共培养，证实其通过释放miRNA逆转上皮间质转化的过程，并重点研究了MCS-Exo对I-κκB(其触发与NF-κB呈正相关)活性的影响，并指出MSC-Exo通过其miRNA减少I-κκB并增加其泛素化，导致抑制NF-κB和Hedgehog通路，以上两个通路均是上皮间质转化过程的重要通路，这也意味着对肺纤维化的逆转作用[54]。另有研究通过miR-100y抑制剂转染敲低MSCs 外泌体中的miR-100，将其与博来霉素诱导的肺泡上皮细胞共培养发现MSC-Exo的治疗效果明显降低证实MSC-Exo 转移的 miR-100 在急性肺损伤中的治疗作用。

三、MSCs及MSC-Exo治疗ARDS的临床应用进展

MSCs及MSC-Exo在ARDS后肺纤维化的治疗作用已有大量的基础实验验证，临床研究开展尚少，大部分小规模临床研究继于新冠病毒肺炎爆发后初步开展，在一项双盲、1/2a 期、随机对照试验中，12名新冠后ARDS受试者分别于发病时和第 3 天接受(100±20)×106脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的静脉输注，对比对照组无不良事件发生，并证实在第6天后接受 UC-MSC 治疗的受试者的炎症细胞因子显著降低[55]。另一项随机对照试验中20 名患者接受了 1×106/kg UC-MSCs静脉输注，相比于对照组，患者生存率提高4.5倍，并证实其可通过免疫调节调控抗炎水平降低白介素水平抑制细胞因子风暴[56]。理论上，MSCs的直接输注存在一定的风险，其治疗剂量及给药次数也是研究的重点，目前尚无明确的指南推荐，但在一项多中心2b 期试验，受试者5天内接受 3 次静脉输注 1×106/kg UC-MSCs，证实重复给药并未带来不良事件发生[57]。相较于MSCs的直接输注，理论上认为，MSC-Exo的安全性更高，在一项前瞻性研究中，24名新冠肺炎所致中重度ARDS患者接受单次MSC-Exo 15mL静脉输注，经过一次治疗后患者的氧合明显改善，其中17名患者的肺部炎症反应被有效控制，并且无患者因MSC-Exo输注致病情加重或死亡[58]。目前关于MSCs及MSC-Exo针对ARDS治疗的临床研究仍在不断的进展中，尚无临床试验直接研究其对ARDS后肺纤维化的治疗作用，但结合基础实验，其对ARDS发生后的炎症控制及免疫调节是抑制ARDS后肺纤维化的治疗途径，以上相关临床试验在ARDS后肺纤维化的治疗疗效具备一定推导作用。

四、小结与展望

目前，ARDS的发病率及死亡率在全球仍然较高，目前治疗尚以对症支持治疗为主，尽管目前各种治疗手段已有明显的改进，但ARDS的发病率及死亡率并未得到很好的控制，很多急性期患者经治疗即使有好转出院的可能，但其中的大部分患者仍然会因进行性的肺纤维化而死去[7]。现研究支持肺纤维化贯穿ARDS的整个病程，并且肺纤维化是ARDS患者生存率及影响生活质量的重要因素，因此，控制ARDS后肺纤维化的治疗是ARDS治疗重点。

MSCs家族主要成员包括BMSCs、ADSCs和HUMSCs等干细胞成员，近年来应用该类细胞对组织纤维化及其肺部损伤等疾病的治疗已经成为生物医学研究的热点领域。但是MSCs应用于临床治疗局限性大，因此具有MSCs同等功效且性质更加稳定，且风险更低，储存更方便等优势的外泌体逐渐成为研究热点[41]。纠正肺纤维化是改善ARDS患者长期预后的治疗重点，研究支持MSCs及MSC-Exo可以用于干预ARDS后肺纤维，但其具体机制尚不完全清楚。因此，有必要进一步研究 MSC 衍生的Exo治疗ARDS后肺纤维化的潜在能力。目前MSCs及Exo在ARDS后肺纤维化的治疗潜力已不断有相应的基础实验数据表明，其在新冠肺炎中的临床应用疗效也有初步的临床数据支持，但针对其用药剂量及疗程尚无明确指南推荐，并且针对其治疗ARDS后肺纤维化的临床应用尚无相关临床研究报道，其中的作用机制仍在不停地探索中。深入研究ARDS后肺纤维化的发病机制及外泌体干预ARDS后肺纤维化的作用机制，是为ARDS后肺纤维化治疗提供精准治疗靶点的重点。