COPD中MicRNA-320c-5p调节SERPINA1基因表达的研究

任 杰，祖力皮喀尔·阿卜杜热合曼，弓 慧，钟雪梅，郑爱芳，李 黎

(新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院呼吸与危重症医学科， 新疆 喀什 844000)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种原因复杂的异质性疾病[1]。SERPINA1是SERPINA家族成员，是编码α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin，AAT)的关键基因,AAT缺乏是与COPD有关的遗传危险因素[2]。本团队前期研究发现，SERPINA1基因rs9944155可能与维吾尔族COPD的发病有关，SERPINE2基因rs16865390与喀什地区COPD易感性无明显相关性。有研究报道，SERPINA1 rs8004738的单核苷酸多态性可增高人群COPD的患病风险[3]。因此，SERPINA1在COPD发生发展中具有重要作用，目前关于COPD中miRNA与SERPINA1相互的靶向调控关系的研究报道较少，其机制尚不完全清楚。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1载体、菌种及细胞 DH5α感受态细胞购自天根公司，293T细胞、人正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)购自ATCC公司(货号CRL-9609)。psiCHECK2载体和Dual-Luciferase报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

1.1.2酶及主要试剂 总RNA提取试剂Trizol、转染试剂Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；miRNA提取试剂盒(miRNeasy Mini Kit，217004)、miRNA转录试剂盒(miScript Ⅱ RT Kit，218161)均购自QIAGEN公司；PCR TAQ酶、连接酶购自TAKARA公司；胶回收和质粒小提试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；点突变试剂盒购自NEB公司Site-Directed Mutagenesis Kit。miR-320c-5p模拟物(mimics)由Invitrogen公司设计并合成。高糖DMEM、DMEM/F-12培养液购自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM和Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；Prime Script RT-PCR Kit和SYBR Premix ExTaq Ⅱ均购自TaKaRa公司。miR-320c-5p mimics及其阴性对照片段NC mimics购自上海吉玛生物科技公司产品；miRNA特异性引物和定量PCR引物购自上海生工。

1.2方法

1.2.1COPD细胞模型的建立 CSE的制备，方法参照文献[PRKN-regulated mitophagy and cellular senescence during COPD pathogenesis]。取一支香烟均速从装有25 mL DMEM注射器中冒出，这种培养液定义为100% 浓度的香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)。每次100%CSE需要新鲜制备，并使用DMEM稀释到最终工作浓度(浓度比10%)，在30 min内使用。正常BEAS-2B当细胞汇合度达到为80%～90% 时，用3% CSE处理24 h，即COPD细胞模型。后续进行基因表达检测。

1.2.2Realtime RT-PCR检测目标microRNAs和SERPINA1基因表达 将人正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)和COPD细胞培养至48 h收集细胞。使用QIAGEN公司miRNeasy Mini Kit试剂盒提取细胞microRNAs，miScript Ⅱ RT Kit试剂盒进行microRNAs转录。Trizol法提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定OD230、OD260值后，进行反转录。

SERPINA1基因引物，F：5′-GACACCGAAG-AGGCCAAGAA-3′；R:5′-TGGAAGTCCTCTTC-CTCGGT-3′(位置564～745，产物长度182 bp)。MicroRNAs上游检测引物(F)如下：MiR-26-5p:5′-TTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3′，MiR-320c-5p:5′-AAAAGCTGGGTTGAGAGG-3′，MiR-210-5p:5′-AGCCCCTGCCCACCGCAC-3′，MiR-96-3p:5′-AATCATGTGCAGTGCCAATATG-3′。

使用2△△CT法对SERPINA1 mRNA水平的表达进行定量分析。结果分析时，获得基因的CT值，取基因CT值与β-actin基因浓度值的比值作为基因相对表达量。

1.2.3Luciferase报告基因载体构建 取人正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)，使用酚氯仿抽提基因组DNA，设计引物使用TAQ酶进行PCR扩增SERPINA1 基因3′UTR区域，使用Not1和 Xho1双酶切PCR产物和psiCHECK载体后，T4连接酶进行DNA连接反应，热激转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒。阳性质粒标记为SERPINA1-WT。以为SERPINA1 -WT质粒为模板，设计点突变引物，使用NEB公司 Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒按照说明书进行MiR-320c-5p分子靶位点突变，突变后质粒命名为SERPINA1-MT。

SERPINA1 基因3′UTR区域参照NCBI序列(NT_187601)，PCR扩增引物如下，WT-F：5′-ATAACTGCCTCTCGCTCCTCAAC-3′；WT-R:5′-TGCAAGAAATGTAGTTCTA-3′(位置12 184～13 889，产物长度1 705 bp)。点突变有两对引物，序列如下，MT-F1：5′-ATAACTGCCTCTCGCTCC-TCAAC-3′；MT-R1：5′-GAATCCTCACGATAC-GGACCT-3′(斜体序列为MiR-320c-5p分子靶位点，下划线为突变位点，原序列为GCT)；MT-F2：5′-AGGTCCGTATCG-TGAGGATTC-3′(斜体序列为MiR-320c-5p分子靶位点，下划线为突变位点)；MT-R2:5′-TGCAAGAAATGTAGTTCTA-3′。PCR扩增采用如下体系：TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板2 μL(100 ng)，补水至25 μL；反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。

1.2.4细胞转染 将293T细胞接种于6孔板中，密度为4×105个/孔，用含10% FBS的DMEM培养液培养24 h，细胞融合度达 70%～80%进行后续的转染。按照说明书溶解miR-195模拟物以及阴性对照NC，浓度为20 μmol/L。在聚丙烯管里准备Lipectamine 3000和DNA复合物：在聚丙烯管中加入0.5 mL预热的Opti-MEM培养基，加入miR-195模拟物100 nM和SERPINA1-WT的野生型和SERPINA1-MT突变型质粒2 μg，轻轻混匀后室温放置10 min。在另一个管中加入0.5 mL预热的Opti-MEM培养基，再加入8 μL Lipectamine 3000。轻轻混匀后室温放置10 min。将上述稀释好的DNA与脂质体混合。混合物置于室温孵育20 min。6 h后，移去脂质体和DNA复合物，在每个培养皿中重新加入2 mL新鲜的培养液，转染48 h后收集细胞，检测Luciferase报告基因活性。

1.2.5Luciferase报告基因检测 选取转染48 h后293T细胞，用 PBS 冲洗细胞3遍后，加入1×PLB裂解液500 μL，室温下裂解15 min。4 ℃离心10 min，吸取上清液进行检测。将100 μL试剂盒中LAR Ⅱ液加入96 孔酶标板中，将20 μL细胞溶解物转移到含有100 μL LAR Ⅱ液的酶标板中，吹打混匀。在多功能酶标仪上检测Firefly 荧光素酶读数。加入100 μL Stop&GloReagent，短暂混匀后测定Renilla荧光素酶读数。样品的相对荧光素酶活性即为 Firefly/Renilla 荧光素酶读数。

1.3统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料比较采用t检验，三组间采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13%CSE细胞中5个miRNA本底表达水平结果 在3%CSE细胞株中提取总RNA，应用 RT-qPCR荧光定量方法分别对MicR-26-5p、MicR-320c-5p、MicR-210-5p、MicR-96-3p进行反转录扩增，用U6作为内参，结果显示MicR-320c-5p及MicR-96-3p的表达量明显低于其他，表达值分别为0.48、0.45(P<0.05),SERPINA1mrna为 3.41表达上调(P<0.05)，3%CSE中MicR-320c-5p、MicR-26-5p、MicR-210-5p、MicR-96-3p表达均下调，SERPINA1表达上调，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3%CSE细胞中5个miRNA本底表达水平结果Table 1 Results of background expression levels of five miRNAs in 3% CSE cells

2.2MicR-320c-5p与3′UTR的结合及突变位点 本研究通过生物信息学预测软件预测MicR-320c-5p和SERPINA1的3′UTR存在互补结合位点，同时构建SERPINA1 3′UTR的突变位点，见表2。

表2 MicR-320c-5p与3′UTR的结合及突变位点Table 2 Binding and mutation sites of MicR-320c-5p and 3′UTR

2.3双荧光素酶活性结果 为了进一步验证micR-320c-5p是否调控SERPINA1-3′UTR中的表达，本研究将micR-320c-5p与野生型或突变型SERPINA1-3′UTR结合，然后将双荧光素酶报告质粒转染到293T细胞，使用mimic阴性对照作为对照组，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光。结果显示，micR-320-5p mimic和SERPINA1野生型3′UTR构建体的相对荧光素酶活性明显下降，和对照组相比差异有统计学意义(P<0.001)，而在SERPINA1突变型3′UTR构建体的相对荧光素酶活性无明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，结果表明，micR-320c-5p可以直接靶向SERPINA1的3′UTR序列，SERPINA1是miR-320c-5p的直接靶基因。

荧光素酶数值：SERPINA1-WT+NC 100%与SERPINA1-WT+miR-320 mimics 65.63%比较，差异有统计学意义[(100.00±0.17)%vs.(65.63±0.41)%，P<0.001]；SERPINA1-MT+NC 95.21%与SERPINA1-MT+miR-320 mimics 95.81%比较，差异无统计学意义[(95.21±0.23)%vs.(95.81±0.38)%，P>0.05]。

3 讨 论

COPD基因多态性与环境因素共同增加疾病发展的风险，其临床表现和致病机制存在异质性[4]。miRNA(MicroRNA)是18～24 kb大小的非编码RNA，通过与mRNA的3′UTR结合来调控基因表达，参与细胞增值，细胞周期调控等过程[5]。研究显示，miRNA在COPD中参与细胞通信，气道上皮重塑和炎症免疫等过程[6]。有研究表明，血液中miRNA-320家族表达下调，降低生存率，在COPD中miR-34c表达下调，负调控SERPINE1的表达[7]。抗胰蛋白酶缺乏症(alpha-1 antitrypsin defificiency，AATd)可由SERPINA1的双等位基因突变引起，是COPD发病的重要遗传危险因素，SERPINA1基因突变可增加COPD患病风险，其病理生理作用由表达、调控或转录后修饰的差异决定[8]。研究表明，醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase)NQO1可结合SERPINA1 3′UTR，NQO1可能与抑制SERPINA1mRNA翻译的miRNA结合，促进SERPINA1mRNA的翻译，增强抗胰蛋白酶的表达(novel RNA-binding activity of NQO1 promotes SERPINA1 mRNA translation)[9]。NQO1对SERPINA1mRNA翻译的影响是否由其他microRNA的相互作用来调节尚不清楚。在TFEB基因转移后，还检测到SERPINA1mRNA和单体的显著减少(autophagy master regulator TFEB inducesclearance of toxic SERPINA1/α-1-antitrypsin polymers)，SERPINA1表达降低是由于SERPINA1聚合物降解增加，进而导致NF-κB活化及白细胞介素6减少，激活的NF-κB和白细胞介素6均能促进SERPINA1的转录。肝脏NF-κB活性降低可促进SERPINA1基因表达及肝脏修复。miRNA通过与编码区或非编码区(非翻译区3′UTR和5′UTR)中的靶mRNA序列互补结合来调节基因表达，这些非编码RNA的表达改变已被证明与COPD发病及预后相关[10]。

既往研究显示，在COPD患者中miRNA存在差异性表达，部分上调(miR-1246、miR-1258、miR-556-3p、miR-1468-5p、miR-126-5p和miR-130b-5p)部分下调(miR-182-3p、miR-497-5p和miR-492)[11]。本研究发现，在3%CSE细胞中micR-320c-5p、micR-96-3p、micR-210-5p及micR-26-5p表达均降低(P<0.01)，有研究显示，miR-210在COPD患者血浆中上调，可作为COPD的早期诊断标志物[12]，本研究结果与之存在差异，同类研究显示micR-320b在COPD存活和非存活患者之间存在明显差异性高表达，与生存周期呈正相关，且在白细胞中表达，参与免疫调节，抑制与COPD相关的癌症的发展[13]，本研究结果与之相符。

SERPINA1在呼吸系统疾病中的影响表现各异，依赖于其表达调控作用。本研究显示，在3%CSE细胞中SERPINA1 mRNA呈现高表达。SERPINA1基因的SNPrs8004738与中国人群中患COPD的高风险相关，而关于SERPINA1与COPD的相关研究较少。动物实验研究表明，SERPINA1 mRNA可增加体内肺脏及肝脏SERPINA1蛋白的含量[14]，与本研究SERPINA1 mRNA在3%CSE细胞中表达量上调结果相符，进一步佐证了SERPINA1 mRNA影响COPD的表达调控。

既往研究显示，在肺囊性纤维化等相关肺部疾病中microRNAs可以结合同源序列来抑制靶向SERPINA1(A1AT编码基因)mRNA的miRNAs的表达，为靶向治疗提供替代策略[15]，而在COPD中缺乏相关研究，SERPINA1的表达上调与miR-320的表达下调是否存在靶向性的关系尚不明确，未见相关报道，本研究结果显示过表达miR-320-5p后的相对荧光素酶活性明显下降，而SERPINA1-3′UTR突变后的荧光素酶活性无显著下降(P>0.05)，结果表明micRNA-320c-5p与SERPINA1的3′UTR序列存在靶向性关系，负调控SERPINA1的表达。

综上所述，本实验利用RT-qPCR发现miRNA在3%CSE中低表达，SERPINA1高表达，验证了micR-320c-5p可负调控SERPINA1的表达，为进一步研究miRNA在COPD中发生发展机制中的作用提供了实验基础，提供治疗方向。但对MicR-320c-5p如何调节SERPINA1的表达及是否受相应炎症因子调节通路的影响，有待进一步的探究，目前仍缺乏COPD中miRNA的综合性研究，可为COPD的治疗策略提供新的治疗靶点和方向。