即食果蔬中致病微生物检测技术及研究进展

蒋静娴，杨丹妮，张晓金

（常州市食品药品纤维质量监督检验中心，江苏常州 213000）

随着人们物质生活水平的日益提升和媒体对食品安全问题的频频曝光，消费者对“舌尖上的安全”越来越关注，对食品的营养价值、感官品质及安全卫生等需求也不断提高。即食果蔬由于具有方便、新鲜、营养丰富等优点，近年来深受消费者的喜爱，鲜切果蔬产业也因此得到了快速发展[1]。

即食果蔬是以新鲜水果或新鲜蔬菜的一种或多种为原料，经过预处理、清洗、去皮或不去皮、切分或不切分以及消毒等加工处理，密封包装后销售，是可直接食用的产品。但即食果蔬未经高温杀菌处理，在去皮、去核、切分等加工过程中以及在运输和贮藏过程中，极易受到微生物污染。

1 即食果蔬中致病微生物的危害

即食果蔬中的致病微生物主要分为细菌和病毒两类。病毒中较为典型的是诺如病毒和轮状病毒，这两种病毒可以引起腹泻、呕吐、头痛和发热等症 状[2-3]，主要通过粪-口传播、昆虫移动传播、病毒携带者传播等方式污染即食果蔬。

据美国疾控防控中心2015年的一项调查研究[4]显示，美国沙门氏菌的感染致病事件呈现逐年增长的趋势，而且在美国食物中毒致死的案例中，由沙门氏菌感染引发的案例占比较高。我国也有相关报道[5]表明，沙门氏菌是引发食源性疾病的“罪魁祸首”。沙门氏菌属于肠杆菌科，感染后会导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病，主要临床表现是腹泻、呕吐、发烧和腹痛等[4]，还会引起关节炎、脑膜炎、心肌炎等并发症。现已有调查研究[6]表明，沙门氏菌的生存能力极强，可在蔬菜、水果、各种肉制品上长期存活。但实际上，在即食果蔬上易存活的致病微生物远远不止沙门氏菌一种，还包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、诺如病毒以及轮状病毒等。

单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌已被证实可以在鲜切哈密瓜、鲜切火龙果、鲜切木瓜等多种即食果蔬上繁殖生存[7]。近20年来，美国发生的性质最恶劣的食物中毒事件就是由单核细胞增生李斯特氏菌感染引起的，在2011年7月末至10月初出现了110例相关病例报告[8]。金黄色葡萄球菌可导致局部化脓性感染，如肠胃炎、肺炎、心包炎等，严重时会引发脓毒症、败血症等全身性感染[9]。

虽然在正常情况下，大肠埃希氏菌是与人体互利共生的肠道菌群之一，但在机体免疫力低下等特殊情况下，其危害不容小觑。有调查显示[10]，大肠杆菌O157∶H7引起的食物中毒事件占食源性疾病事件的34.3%。

2 致病微生物的常见检测技术

2.1 传统分离鉴定法

传统分离鉴定法是通过观察微生物的形态特征和生理/生化反应等对其进行微生物学分类鉴定，具体过程包括增菌、分离培养、形态学观察、生理/生化鉴别以及血清学鉴别5个步骤[11]。传统的培养分离鉴定法有较高的鉴定准确度，较低的设备要求，常作为检验标准。对于沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌等常见致病菌的微生物学检验，我国现行有效的食品安全国家标准均采用的是传统分离培养鉴定法。

2.2 免疫学检测法

免疫学检测法是一种根据抗原抗体的特异性反应建立的检验与分析方法。酶联免疫吸附法是目前发展较成熟、应用较广泛的免疫学检测法，具有选择性高、准确高效、操作简单等优势。该方法将抗原-抗体的特异性反应与酶的催化作用相结合，用酶标记抗原或抗体，在固相载体表面发生反应，经洗涤后通过特定的酶促反应产生有色物质来判定结果。但常规酶联免疫吸附法的检测灵敏度容易受前处理方法和采样时间等因素的影响，可能出现假阴性的结果，而且对仪器设备和操作人员的要求也比较高[12]。

2.3 生物传感器法

生物传感器法是通过将某种生物活性物质的浓度转换为电信号来识别待测物质的一种检测方法。生物传感器一般由生物感应元件和信号转换器两部分组成。生物感应元件是指酶、微生物、抗原/抗体、激素、细胞和组织等固定化的生物活性物质。信号转换器包括氧电极、场效应管、光敏管和压电晶体等[13]。根据信号转换器的不同，生物传感器可分为光学生物传感器、电化学生物传感器和压电生物传感器。生物传感器具有信号反应快、设备成本低、样品用量少等技术优势。

2.4 核酸检测方法

基于核酸的检测方法是利用分子生物学方法对微生物中特定的基因序列进行检测的方法。应用于食源性微生物中最常用的核酸检测方法是聚合酶链式 反 应（Polymerase Chain Reaction，PCR）。PCR技术目前已经广泛应用于多种食源性致病菌的检测，但由于常规PCR方法检测通量较低，且无法实现定量，所以近年来在常规PCR的基础上衍生出了基因膜芯片技术、多重PCR技术、荧光定量PCR技术和环介导等温扩增反应（LAMP技术）等[14]。

3 即食果蔬中致病微生物检测技术的研究进展

目前，我国对食源性致病菌的检验检测最常采用的是传统的培养分离鉴定法。但这种方法耗费太多的人力、时间、物资等，不仅不适用于食源性致病微生物的快速检测，也不利于对食品安全潜在风险的即时排查与控制。所以，目前迫切需要一种高效率、高准确度、低成本且单次实验可满足多指标筛检要求的快速检测技术来对即食果蔬中的多种致病微生物进行同时检测。

基因膜芯片法利用“反向斑点杂交”将基因中的特异性基因序列（DNA探针）固定在尼龙膜等载体上，然后待测靶标基因与芯片上的探针特异性结合，最后通过酶-底物显色判读结果。基于膜芯片技术，常州市食品药品纤维质量监督检验中心联合四川华汉三创生物科技有限公司开发了一种可以同时检测即食果蔬中6种食源性致病微生物（4种细菌和2种病毒）的膜芯片检测体系，即可用一种方法同时检测多个致病微生物。

该方法采用独特的多重PCR技术与反向斑点杂交技术相结合的检测体系，同时提取细菌和病毒中的DNA和RNA，并且同时扩增其中的特异性基因片段，最终以大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、诺如病毒和轮状病毒中的特异性保守序列为检测靶标，在如图1所示的膜芯片上形成肉眼可见的检测靶点，实现所有检测靶标的共同检测。该方法大大降低了相关检测工作的技术门槛，显著提高了检测人员的工作效率，兼具高通量、高效率、高灵敏度等多重技术优势，达到了省时、省力又省成本的目的。与分离鉴定法等传统检测方法相比，该方法具有极大的竞争优势，如果广泛应用将会对食品质量安全管理、食品市场秩序维护、区域经济发展等领域都具有重要意义。

图1 膜芯片样式

4 结语

食品安全是当前最大的民生问题。对食品中致病微生物的快速检测是有效控制食品安全事件发生的关键环节。随着微生物检测技术研究的不断深入，对食源性致病菌的检测从传统的分离鉴定法发展到现在的酶联免疫吸附法、生物传感器法和分子生物学技术等。但传统分离鉴定法操作烦琐、耗时耗力；酶联免疫吸附法的特异性和灵敏度有待提高；生物传感器法检测费用高，不利于推广。未来我国微生物检测技术的研发方向应该是操作更加简便快捷、特异性和灵敏度更高、对检测人员的专业性要求更低的检测技术及仪器产品，努力形成现代化的食源性致病菌快速检测体系，最大限度地防止及控制食品安全突发事件的发生。