活性氧簇调控破骨细胞分化的研究进展

张家胜 王剑 郁婷婷

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心遗传分子诊断科，上海 200127

骨骼是人体运动系统最重要的组成部分。在人体整个生命周期中，骨骼通过严格调控旧骨吸收和新骨生成的平衡来维持骨重塑稳态。破骨细胞负责骨吸收，是控制骨重塑的关键细胞，对维持骨稳态平衡至关重要[1-2]。研究发现，胚胎第7天左右，红细胞髓系祖细胞出现在卵黄囊造血岛，并分化为集落刺激因子1受体(colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)阳性卵黄囊巨噬细胞，可作为破骨细胞的前体[3]。出生后，这些前体细胞逐渐被造血干细胞来源的单核细胞前体所取代，并相互融合，部分也与长期存活的红细胞髓系祖细胞来源的破骨细胞合胞体反复融合，形成多核破骨细胞[4]。破骨细胞分化成熟是发挥骨吸收功能的前提，其分化过程受多种因子调控。

研究显示，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是破骨细胞分化成熟过程中关键的细胞内信号转导分子[5]，对破骨细胞分化具有重要的调控作用，针对ROS清除的抗氧化剂可抑制破骨细胞分化成熟[6-9]。本文就ROS调控破骨细胞分化成熟的研究进展进行综述，以期为溶骨亢进型疾病如骨质疏松症等提供更广泛的治疗思路。

1 破骨细胞分化过程中ROS的产生与清除

ROS是氧气转化为水的过程中氧化还原反应的中间产物，包括氧自由基和非自由基氧化剂。氧自由基包括超氧阴离子(·O2ˉ)和羟基(·OH)等。非自由基氧化剂包括过氧化氢(H2O2)、臭氧(O3)和高反应性脂质或碳水化合物衍生的羰基化合物等[10]。

细胞内ROS主要在线粒体和细胞膜上产生。在氧化磷酸化过程中，线粒体活性氧簇 (mitochondrial ROS, mtROS)主要通过线粒体内膜上的电子传递链产生。例如，·O2ˉ是通过线粒体呼吸链复合物Ⅰ的异咯秦半醌(FAD)、泛醌、复合物Ⅲ的细胞色素b566、辅酶Q等还原辅酶或辅基将单个电子转移到氧分子上而产生的[11]。细胞膜上ROS的生成主要由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)介导。NOX由多个蛋白亚基组合而成，位于质膜上的亚基被激活后，磷酸化并招募胞内亚基，形成有活性的NOX复合体。激活的NOX复合体直接从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)向游离氧分子转移电子，生成ROS[12-13]。

在NOX家族的7个成员中，破骨细胞主要表达可生成·O2ˉ的NOX1/2和生成H2O2的NOX4[14]。核因子κB受体激活因子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)信号募集和激活TRAF6后，可激活小GTP酶RAC1，其激活后可与NOX1的胞内亚基结合组成复合物，从而激活NOX1，短暂生成ROS[15]。NOX2的质膜亚基gp91phox对于生成ROS起重要作用，其敲除小鼠模型的骨髓源性单核巨噬细胞定向分化过程产生破骨分化缺陷表现，且可被H2O2补偿[16]。Nox4敲除小鼠骨密度较高，破骨细胞数量和标志物减少[17]。利用基因敲除和敲低技术相结合的方法，研究[18]发现在促破骨细胞分化时，NOX1和NOX2之间存在灵活的代偿机制，而NOX4并不参与该代偿机制。最新的研究[19]发现，破骨细胞表面的髓系细胞触发受体2 (Trem2)是调节细胞内ROS产生的另一关键分子，其被激活后可与受体DAP12结合，从而激活酪氨酸激酶Syk，使ROS产生增加。

细胞内抗氧化机制可清除ROS，阻止其过量积聚，从而维持细胞内ROS的稳态[20]。在抗氧化酶中，最具代表性的是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，它通过将·O2ˉ转化为H2O2而降低其活性[21]。由SOD催化产生的H2O2可被过氧化物酶体和细胞浆中的过氧化氢酶(catalase，CAT)转化为水和分子氧[22]。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是另一重要的抗氧化酶，其与酶解产物如胆红素和一氧化碳等共同发挥抗氧化、抗炎作用[23-24]。HO-1的表达受抗氧化蛋白NRF2所调控。氧化应激条件下，NRF2磷酸化入核与小MAF蛋白组成异源二聚体，与抗氧化反应元件(anti-oxidant response element, ARE)结合，促进HO-1的转录[25-26]。

2 ROS对破骨细胞分化成熟的调控

在破骨细胞分化过程中，RANKL/核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)信号转导通路是调控破骨前体细胞向破骨细胞分化成熟的关键信号通路[27]。骨髓基质细胞和成骨细胞分泌的RANKL与破骨细胞表面RANK结合后，诱导肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor associated factors，TRAFs)的募集和激活，导致核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB )、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)、转录因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)和AKT等多种信号级联反应的激活。这些信号级联反应最终促进活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的转录，进而促进破骨细胞分化和多种溶骨相关基因如ACP5、CTSK和MMP9等的表达，促使破骨细胞发生融合、细胞骨架重塑和发挥骨吸收功能[28-30]。

ROS在破骨细胞分化过程中的调控作用早在上世纪90年代就有研究。在体外培养诱导分化破骨细胞时无论直接添加H2O2还是SOD诱导产生H2O2均可促进骨吸收[31-32]。后续发现，砷诱导产生的H2O2促进破骨细胞分化的作用在较低浓度内具有剂量依赖性[33]。近期报道[34]，破骨细胞内抗氧化蛋白NRF2的缺乏增加了砷诱导的H2O2水平和p38的磷酸化。此研究揭示了H2O2浓度上升与破骨细胞内MAPK信号通路激活之间的潜在联系。随着ROS检测技术的不断进步，其在细胞内的信号调节作用不断被阐明。研究者运用DCFH-DA荧光探针技术发现，ROS的产生随着RANKL浓度的增加而增加[35]。随着H2O2的加入，IκBα 和AKT以及ERK、JNK,、和p38的磷酸化程度呈剂量依赖性增加[35]。Satish Srinivasan等[36]利用电子自旋共振(electron paramagnetic resonance，EPR)捕获技术，发现微缺氧条件下，ROS产生增加，IκBβ水平下降，破骨细胞分化增强，且可被抗氧化剂逆转。在一项糖尿病引起骨质疏松的机制研究[37]报道中，研究者发现，体外利用高糖培养基来培养破骨细胞，可使ROS的产生增加，导致ERK、JNK和p38及IκB的磷酸化加强，并上调IKK，从而增强破骨细胞分化。综上，随着ROS检测技术的进步和H2O2与高糖培养基质及微缺氧培养条件的建立，ROS通过NF-κB、MAPK和AKT等多条信号通路调控破骨细胞分化的机制逐渐被阐明[38-39]。研究[40]显示，以上信号通路中，磷酸化酶催化位点处的半胱氨酸解离常数(pKa )较低，主要以硫醇形式存在，可被ROS进行氧化修饰从而影响该酶的催化活性。而在破骨细胞中，ROS对于多条信号通路的调控是否通过半胱氨酸的氧化修饰来实现还未有研究。

除调控破骨细胞分化外，ROS也可能参与破骨细胞凋亡调控。据报道，含氮双膦酸唑与原儿茶酸均可下调ROS并诱导破骨细胞凋亡，而香烟烟雾提取物可激活ROS并抑制破骨细胞凋亡[41-43]。但目前ROS调控破骨细胞凋亡的分子机制还不清楚，且以上研究与激活ROS促进肿瘤细胞凋亡的研究结果[44]不一致，故ROS在破骨细胞凋亡中的调控作用及机制还有待进一步研究。

3 ROS作为溶骨性疾病治疗靶点的研究进展

由于ROS可通过多条信号通路调控破骨细胞的分化成熟，故将ROS作为靶点的抗氧化剂对于溶骨性疾病的治疗研究也常有报道。研究[45]发现，老年人和女性人群的血浆中，抗氧化剂的含量明显减少。在卵巢切除小鼠中应用N-乙酰半胱氨酸(NAC)或抗坏血酸盐等抗氧化剂可以减少雌激素下降引起的骨丢失[46]。一些回顾性队列研究[47-50]发现，服用常见抗氧化剂如维生素C、维生素E、 NAC和硫辛酸(LA)的人群骨密度(bone mineral density，BMD)相对较高。

近年来，众多新型抗氧化剂显现出对破骨细胞分化成熟的靶向抑制作用，有望为骨质疏松症等溶骨亢进型疾病提供治疗新思路。根据其抗氧化作用原理不同，可将这些抗氧化剂分为两大类，即抑制ROS产生型和促进ROS代谢型(表1)。

表1 新型抗氧化剂对于破骨细胞分化成熟的靶向调控Table 1 Targeting effects of novel antioxidants on osteoclast differentiation and maturation

抑制ROS产生型抗氧化剂包括米托蒽醌甲磺酸盐(MitoQ)、木黄酮和葛根素和阿齐沙坦等，主要通过抑制ROS的产生，从而抑制破骨细胞分化。例如，MitoQ是一种线粒体特异性抗氧化剂，其可抑制缺氧环境下的mtROS的产生，从而通过抑制NF-κB信号通路来抑制破骨细胞分化[36]；木黄酮通过抑制NOX1的翻译和激活来减少破骨细胞内ROS的产生从而抑制破骨细胞形成[7]；葛根素通过下调TRAF6和NOX1的表达，抑制TRAF6/ROS依赖的MAPK和NF-κB信号通路，从而抑制破骨细胞分化[8]。近期[51]发现，一种血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂阿齐沙坦可下调NRF2的表达以抑制ROS 的产生，来抑制MAPK和NF-κB信号通路，从而抑制破骨分化。

促进ROS代谢型抗氧化剂包括姜黄素、髓过氧化物酶和白桦提取物BAG等，主要通过促进ROS代谢分解，从而抑制破骨细胞分化。例如，姜黄素可上调NRF2的表达并增强SOD和CAT活性而促进ROS的代谢，通过NF-κB/AKT信号通路来抑制NFATc1的表达，从而抑制破骨细胞分化成熟[52-54]。姜黄素环糊精包合物与金纳米制剂联用在体外证实可提高卵巢切除诱导骨质疏松模型的骨密度[55]。一期临床试验[56]结果表明，姜黄素可提高骨密度和减少骨吸收，对骨质疏松过程有抑制作用。姜黄素和阿仑膦酸盐联合治疗可调节骨质疏松绝经后妇女的骨转换标志物并提高骨密度[57]。髓过氧化物酶通过分解细胞内H2O2，抑制破骨细胞发生和骨吸收[58]。有H2O2暴露时，辅酶Q10可提高SOD和CAT酶活性及氧化应激相关蛋白的表达来加速ROS代谢，以抑制RANKL诱导的破骨细胞分化[59]。

4 小结与展望

本文总结了ROS在破骨细胞分化成熟过程中的调控作用。破骨细胞在分化过程中伴随着ROS的产生，ROS通过调节NF-κB、MAPK和AKT信号通路，促进破骨细胞分化成熟。将ROS作为靶点的常见抗氧化剂可作为治疗溶骨性疾病的全新方向。近年来，多种新型抗氧化剂特异性靶向ROS产生和代谢酶类，通过抑制ROS产生或促进ROS代谢从而抑制溶骨作用，为溶骨亢进型疾病治疗药物的研发提供了新思路。

尽管不同抗氧化剂均通过降低破骨细胞的ROS水平，从而抑制破骨细胞分化，但其所调控的信号通路却有所不同，这其中的机理还未有研究。虽然在众多新型抗氧化剂治疗溶骨性疾病研究中的大部分仍处于基础研究和早期临床试验阶段，但由于靶向分子的多样性以及调控信号通路的可选择性，使其在精准医疗中具有巨大潜力。