基于ERK/mTOR信号通路探讨六味地黄丸对氧化应激状态下成骨细胞自噬的影响

谢丽华 郭澜 陈赛楠 李生强 陈娟 葛继荣*

1.福建省中医药科学院骨质疏松证候基因组学研究室，福建 福州 350003

2.福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室(福建省中医药科学院、福建中医药大学附属康复医院)，福建 福州 350003

3.福建中医药大学，福建 福州 350122

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是绝经后妇女雌激素水平下降引起的一种全身骨代谢性疾病，其特征为单位体积骨量减少，骨组织微结构破坏，从而导致骨脆性增加，骨折风险升高[1]。肾阴虚证是绝经后骨质疏松症临床常见证型之一，六味地黄丸具有滋阴补肾的功效，常用于治疗肾阴虚型绝经后骨质疏松症，能够改善临床症状、提高骨密度[2-3]。本课题组持续关注六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症分子机制问题[4-7]，前期研究结果显示，六味地黄丸防治骨质疏松的作用机制可能与自噬相关[8]，但其作用的具体机制需进一步探讨。

自噬是一种高度保守的细胞内物质分解代谢、循环过程[9]，在正常情况下，适宜水平的自噬可以促进成骨细胞的增殖并减少其凋亡。研究证明，氧化应激产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)能诱导自噬发生，自噬又可以降低ROS水平，调节细胞氧化应激水平[10]。目前，对于自噬在PMOP方面相关通路的研究主要以mTOR为主要“中转站”的信号通路为主[11]。ERK通路在机体自噬调节过程中也起到了重要作用[12]，但是具体机制尚不明确。研究表明[13]，自噬作为潜在靶点应用于临床骨病药物的开发将是一大热点。本研究通过H2O2诱导成骨细胞模拟细胞氧化应激状态，观察六味地黄丸含药血清调控ERK/mTOR信号通路对氧化应激状态下成骨细胞自噬的影响，为六味地黄丸临床治疗PMOP提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠20只，体质量180～220 g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2018-0004。于福建省中医药科学院动物房适应性喂养一周后开始实验。动物伦理审查编号：FJATCM-IAEC2020021。

1.2 主要试剂

小鼠颅顶前骨细胞亚克隆MC3T3-E1细胞购自中国科学院细胞库；六味地黄丸浓缩丸(同仁堂，国药准字：Z19993068)；α-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；雷帕霉素Rap(HY-10219)、U0126(HY-12031A)、H2DCFDA(HY-D0940)、CCK-8试剂盒(HY-K0301)均购自MedChemExpress公司；ERK1/2(9101 S)、p-ERK1/2(4370 T)、mTOR(2983 T)、p-mTOR(5536 T)均购自Cell Signaling Technology公司；Anti-LC3B(Abcam，ab192890)；Rabbit Anti-GAPDH(Bioss，bs-10900R)；超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天)。

1.3 方法

1.3.1细胞培养：使用含10%胎牛血清，1%青霉素链霉素双抗的α-MEM培养基复苏MC3T3-E1细胞，置于37 ℃，5%的CO2环境的培养箱中培养。2 d换液一次，当细胞生长融合度达到80%时，用胰蛋白酶消化细胞进行传代，取对数生长期的细胞实验。

1.3.2含药血清制备：将20只SD大鼠随机分为空白组和六味地黄丸组，每组10只。参照文献[14]将六味地黄丸配置成生药浓度0.8 kg/L的水溶液，每天灌胃2次。空白组则灌等量蒸馏水。连续灌胃7 d，第7天首次灌药2 h后腹主动脉取血，制备六味地黄丸(LWDH)含药血清及空白血清。

1.3.3分组及干预：根据课题组前期实验结果[8]，采用0.10 mmol/L H2O2干预细胞24 h，建立体外氧化应激细胞模型。分为正常对照组(Control)：不做干预；模型组(Model)：0.10 mmol/L H2O2；空白对照组(Blank)：20%空白血清+0.10 mmol/L H2O2；六味地黄丸组(LWDH)：20%六味地黄丸含药血清+0.10 mmol/L H2O2；雷帕霉素组(Rap)：5 μmol/L Rap+0.10 mmol/L H2O2；U0126组(U0126)：10 μmol/L U0126+0.10 mmol/L H2O2；雷帕霉素+六味地黄丸组(Rap+LWDH)：5 μmol/L Rap+20%六味地黄丸含药血清+0.10 mmol/L H2O2；U0126+六味地黄丸组(U0126+LWDH)：10 μmol/L U0126+20%六味地黄丸含药血清+0.10 mmol/L H2O2，所有组均干预24 h。

1.3.4细胞活性氧水平检测：细胞接种于6孔板，分组干预后，采用荧光探针检测胞内ROS的含量。探针终浓度为10 μmol/L，置于培养箱中培养1 h后，PBS清洗，置于倒置荧光显微镜下观察。

1.3.5蛋白印迹法：分组收集细胞，提取总蛋白，根据不同蛋白的分子量选择6%(mTOR、p-mTOR)、10%(GAPDH、ERK1/2、p-ERK1/2)、15%(LC3B)SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，转膜。脱脂奶粉封闭4 h，磷酸化蛋白用5% BSA进行封闭。加入对应一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后，加入二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L antibody，室温孵育1.5 h，清洗。使用特超敏ECL化学发光试剂盒曝光，用多色荧光/化学发光成像仪拍照。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 六味地黄丸对成骨细胞ROS的影响

细胞活性氧水平显示，与Control组相比，Model组ROS水平显著提高(#P<0.05)；与Model组相比，LWDH组、Rap组、U0126组、Rap+LWDH组及U0126+LWDH组细胞内ROS水平皆下降(*P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠成骨细胞ROS情况Fig.1 ROS of osteoblasts in each group

2.2 六味地黄丸对成骨细胞自噬的影响

Western blot结果显示，与Control组相比，Model组蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ降低(#P<0.05)；与Model组相比，LWDH组、Rap组、Rap+LWDH组蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ增高(*P<0.05)；与Model组相比，U0126组及LWDH+U0126组蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组大鼠细胞LC3B蛋白表达情况Fig.2 Expression of LC3B protein in each group of cells注：A：Control组；B：Model组；C：LWDH组；D：Blank组；E：Rap组；F：U0126组；G：Rap+LWDH组；H：U0126+LWDH组。与Control组相比，#P<0.05；与Model组相比，*P<0.05。

2.3 六味地黄丸含药血清对ERK/mTOR通路的影响

Western blot结果显示，与Model组相比，LWDH组、Rap组与Rap+LWDH组的p-mTOR蛋白表达下调(*P<0.05)。与Model组相比，Blank组、LWDH组、U0126组的p-ERK1/2蛋白表达下调(*P<0.05)；U0126+LWDH组p-ERK1/2蛋白表达有下调趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 各组间p-mTOR、p-ERK蛋白的表达情况Fig.3 Expression of p-mTOR and p-ERK proteins among the groups注：A：Control组；B：Model组，C：Blank组；D：LWDH组；E：Rap组；F：U0126组；G：Rap+LWDH组；H：U0126+LWDH组。与Model组相比，*P<0.05。

3 讨论

氧化应激是机体的氧化和抗氧化系统之间的稳态被破坏而造成的应激状态。当人体因为衰老、疾病等原因产生ROS过多，而机体消除ROS能力不足时，便产生氧化应激反应。研究表明[15]，绝经后女性雌激素水平降低，抗氧化能力减弱，导致机体的ROS不断堆积无法清除，诱导机体发生氧化应激反应，而骨骼中过多的ROS会抑制成骨细胞的增殖、分化和骨基质的矿化[16]，最终导致骨质疏松[17-18]。课题组前期研究发现[8]，0.10 mmol/L H2O2能够抑制MC3T3-E1成骨细胞增殖，使细胞处于氧化应激状态，可作为成骨细胞氧化损伤模型；且六味地黄丸含药血清体积浓度为20%时，可促进H2O2作用下的成骨细胞增殖活性。本研究结果再次证实0.10 mmol/L H2O2可以作为成骨细胞氧化损伤模型，20%六味地黄丸含药血清以及抑制ERK/mTOR通路都可以抑制细胞内ROS水平，减轻细胞氧化损伤。

有研究表明，自噬可以抑制氧化应激造成的成骨细胞凋亡[19]。成骨细胞特异性敲除自噬基因的小鼠骨矿化能力降低，氧化应激增加，骨小梁骨密度降低了50%[20]。自噬发生过程中最关键的是自噬小体的形成，LC3-Ⅱ通常被看作成自噬形成的标志性分子。mTOR是缺乏氨基酸、生长因子、氧或ATP等细胞应激的自噬反应的汇集点，其通过负向调节的反馈机制，诱导细胞自噬的发生[21]。雷帕霉素通过抑制mTOR通路激活细胞自噬。ERK通路能对细胞外各种信号刺激作出反应，起到一个细胞内外信号传导的作用[22]。研究表明，ERK被抑制后将导致mTOR信号下降，自噬信号提高，自噬通量增加[23]。U0126是ERK通路抑制剂，所以说抑制ERK通路也能促进细胞自噬。

本研究发现，六味地黄丸组、雷帕霉素组以及两者联合干预组的自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值都显著提高，U0126组自噬蛋白有增高趋势，提示六味地黄丸或者抑制ERK/mTOR通路可以促进氧化应激状态下成骨细胞的自噬水平。朱仲康等[24]研究发现六味地黄丸能增加海马神经元中LC3表达，提高海马神经元的自噬水平保护海马神经元细胞。本研究结果显示，六味地黄组p-mTOR蛋白表达下调，与雷帕霉素的作用相似，都可以抑制p-mTOR蛋白的表达；六味地黄丸组p-ERK1/2蛋白表达下调，与U0126的作用相似，都可以抑制p-ERK1/2蛋白的表达。六味地黄丸与U0126联合作用组p-ERK1/2蛋白表达有下调趋势，但还没达到统计学意义，可能是六味地黄丸与U0126产生了某种化学反应，反而影响了相互的药效。以上结果提示，六味地黄丸可以抑制ERK/mTOR通路。通过抑制ERK/mTOR通路，促进氧化应激状态下成骨细胞的自噬，进而抑制细胞ROS水平，减轻细胞氧化损伤。

综上所述，六味地黄丸含药血清通过抑制ERK/mTOR信号通路来诱导MC3T3-E1成骨细胞的自噬，以减轻细胞的氧化应激损伤，这可能是六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制之一。但本研究尚有不足之处，针对六味地黄丸抑制氧化应激状态下成骨细胞的自噬机制研究尚欠，后续将进一步深入探究。