六味地黄丸含药血清通过诱导自噬对氧化应激状态下成骨细胞增殖的影响

郭澜 李莉 葛继荣* 黄景文 柴昊 谢丽华 陈娟 许鹏超

1.福建省中医药科学院，福建 福州 350003

2.福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室，福建 福州 350003

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨代谢疾病，以单位体积骨量减少，骨组织微结构破坏为特征，表现为骨脆性增加，骨折风险增高[1]。目前的调查显示，在我国50岁以上人群中，女性OP发病率达20.7%，男性达14.4%[2]，并且预计到2050年，中老年女性的发病率将高达50%～70%[3]。研究证明，绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的发病机制与雌激素调控、氧化应激和炎症反应、肠道菌群及铁过载等相关[4]。当机体受到有害刺激时会生成大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，若不能被机体及时清除，便会打破氧化/抗氧化平衡，对组织或细胞造成损伤，这种病理反应称之为氧化应激[5-6]，是PMOP的重要发病机制之一[7]。自噬是细胞在饥饿、毒性物质刺激等状态下，自噬小体与溶酶体结合以降解受损的细胞器或功能丧失的大分子蛋白等物质，再供给细胞以维持正常生理功能的过程，对机体的物质循环再利用、维护细胞内环境稳定等起到重要作用[8-9]。研究表明，自噬和氧化应激与骨稳态的维持及OP的发生发展有着必然的联系，靶向调节骨组织细胞自噬水平可以作为一种前瞻性治疗OP的新方法[10]。中医的“骨痿”“骨枯”等范畴，其中肝肾阴虚型OP的推荐用药之一为六味地黄丸[11]。本研究通过H2O2诱导成骨细胞模拟细胞氧化应激状态，之后采用六味地黄丸含药血清共培养，探讨六味地黄丸含药血清对成骨细胞增殖、ROS及自噬水平的影响，为六味地黄丸临床治疗OP提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MC3T3-E1细胞于中国科学院细胞库购买；SD大鼠购于上海斯莱克；α-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，美国)，青链霉素双抗混合液、磷酸缓冲盐溶液(上海源培公司，中国)，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、H2DCFDA、CCK-8试剂盒(MedChemExpress，美国)；六味地黄丸浓缩丸(同仁堂，中国)。RIPA裂解缓冲液(碧云天，中国)；Product Information(APExBIO，美国)；BCA蛋白分析试剂盒(雅酶，中国)；Rabbit Anti-β-actin(bioss，bs-0061R)，Anti-Beclin 1 antibody(Abcam，ab207612)，Anti-LC3B(abcam，ab192890)；特超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1制备六味地黄丸含药血清：将40只SD大鼠随机分为空白组和六味地黄丸组，先于动物房适应性喂养一周。根据六味地黄丸说明书，成人一天总用药量相当于中药饮片9 g，参照徐叔云等[12]的方法，制备生药质量浓度为0.8 kg/L的六味地黄丸水溶液，按每天1.0 mL/100 g对六味地黄丸组大鼠进行灌胃，空白组用等量蒸馏水灌胃。在第7天首次灌药2 h后，麻醉大鼠进行腹主动脉取血以制备六味地黄丸(LWDH)含药血清及空白血清。

1.2.2细胞培养：细胞培养基选用α-MEM培养基，其中含有10%体积分数的胎牛血清，1%体积分数的青链霉素。培养环境为37 ℃，5%体积分数CO2的培养箱中。细胞复苏后2 d换液一次，当细胞铺满培养皿80%～90%时传代，当细胞处于对数生长期时进行实验。

1.2.3CCK-8检测：将MC3T3-E1细胞接种于96孔板，每组设置3～4个副孔，于培养箱中静置24 h以待细胞贴壁，后吸走原有培养基，用H2O2(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L)干预24 h；另外一板细胞用体积分数5%、10%、20%、30%的空白血清、LWDH含药血清干预24 h，后用0.10 mmol/L H2O2继续干预至48 h。干预结束后，按照10 μL/孔加入CCK-8试剂，继续于培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定波长450 nm处吸光值，记录并根据公式计算细胞增殖率。

1.2.4分组及干预：正常对照组(Control)：不做干预；模型组(Model)：0.10 mmol/L H2O2干预24 h；空白对照组(H+Blank)：20%空白血清干预24 h，0.10 mmol/L H2O2干预24 h；六味地黄丸组(H+LWDH)：20%六味地黄丸含药血清干预24 h，0.10 mmol/L H2O2干预24 h；自噬抑制剂组(3-MA+LWDH)：3-MA提前干预1 h，再用20%六味地黄丸含药血清共同干预24 h。

1.2.5细胞活性氧水平检测：将MC3T3-E1细胞接种于6孔板，根据实验分组干预后，采用荧光探针DCFH-DA检测每组细胞的ROS的含量。根据DCFH-DA试剂盒说明书，用PBS配制荧光探针(DCFH-DA)稀释液(探针浓度为10 μmol/L)，每孔加入适量的含有探针的PBS溶液，于培养箱中静置1 h，弃去PBS，用新的PBS轻柔清洗2遍。闭光置于倒置荧光显微镜下观察，并拍照保存。

1.2.6qRT-PCR检测目的mRNA表达：将MC3T3-E1细胞接种于6孔板，于培养箱中培养24 h细胞贴壁后根据分组进行干预。干预结束后，根据分组收集细胞，提取RNA，逆转录成cDNA后，采用qRT-PCR检测成骨细胞Beclin 1、LC3B mRNA表达水平。由上海生工公司完成引物设计，具体引物信息见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.7蛋白印迹法：根据分组收集细胞，使用RIPA裂解缓冲液、Product Information提取细胞中的总蛋白，并通过BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量。SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上，转膜时间根据蛋白分子量确定。用脱脂奶粉4 ℃封闭4 h后，加入相对应的一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后，加入二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L antibody (bs-0295 G)，室温孵育1.5 h，TBST洗涤4次，每次15 min。使用特超敏ECL化学发光试剂盒曝光，用多色荧光/化学发光成像仪(protein simple，美国)拍照保存。

1.3 统计学分析

所有实验均独立重复3次。数据先进性正态检验，符合正态分布采用均数±标准差进行描述，使用SPSS 22.0进行统计学分析。若数据符合正态分布，则进行单因素方差分析；若数据不符合正态分布，则进行非参数检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 过氧化氢对成骨细胞增殖的影响

H2O2的浓度为0.10 mmol/L时，相比于对照组，成骨细胞的平均增值率为70.65%，此浓度对成骨细胞增殖的抑制作用较为显著(P<0.05)；H2O2的浓度为0.20 mmol/L时，成骨细胞平均增殖率不足20%。可见，H2O2对成骨细胞的增殖具有抑制作用，且浓度为0.10 mmol/L时具有相对较小程度的抑制增殖效果，因此选取此浓度进行后续实验研究。见图1。

图1 H2O2浓度对成骨细胞增殖的影响Fig.1 Effect of H2O2 concentration on osteoblast proliferation

2.2 六味地黄丸含药血清对氧化应激状态下成骨细胞增殖的影响

CCK-8结果显示，空白血清对成骨细胞增殖的作用不明显(P>0.05)；而LWDH含药血清对成骨细胞增殖的促进作用呈现一定的剂量依赖性，且体积浓度为20%时，对成骨细胞的增殖促进效果最佳，与空白组对比差异最显著(P<0.05)。LWDH含药血清浓度大于20%后，开始对成骨细胞增殖出现抑制作用。因此，选取LWDH含药血清体积浓度为20%进行后续实验研究。见图2。

图2 血清浓度对成骨细胞增殖的影响Fig.2 Effect of serum concentration on osteoblast proliferation

2.3 六味地黄丸含药血清对H2O2所致成骨细胞氧化损伤的影响

荧光定量分析结果显示，与Control组相比，Model组的荧光强度显著增强(#P<0.05)，说明在H2O2的干预下，成骨细胞处于氧化应激状态。与Model组相比，H+Blank组荧光轻度有所减弱，但差异无统计学意义(P>0.05)；H+LWDH组荧光强度显著减弱(*P<0.05)。说明LWDH含药血清可以降低细胞的ROS水平，减轻H2O2对成骨细胞造成的氧化损伤。见图3。

2.4 六味地黄丸含药血清对自噬相关基因mRNA表达的影响

qRT-PCR实验结果显示，与Control组相比，Model组自噬相关Beclin 1、LC3B mRNA表达明显下调(#P<0.05)。与Control组相比，H+Blank组自噬相关Beclin 1、LC3B mRNA表达无明显变化(P>0.05)；与Model组相比，H+LWDH组自噬相关Beclin 1、LC3B mRNA表达明显上调(#P<0.05)；且与H+LWDH组相比，LWDH+3-MA组自噬相关基因Beclin 1、LC3B mRNA表达明显下调(▲P<0.05)。见图4。

图4 qRT-PCR检测Beclin 1、LC3B mRNA表达情况Fig.4 qRT-PCR detection of Beclin 1 and LC3B mRNA expression注：与Control组相比，#P<0.05；与Model组相比，*P<0.05；与H+LWDH组相比，▲P<0.05。

2.5 六味地黄丸含药血清对自噬相关蛋白表达的影响

蛋白印迹法实验结果显示，与Control组相比，Model组自噬相关蛋白Beclin 1表达明显下调(#P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低(#P<0.05)。与Control组相比，H+Blank组自噬相关蛋白Beclin 1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值无明显变化(P>0.05)；与Model组相比，H+LWDH组自噬相关蛋白Beclin 1表达明显上调(#P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高(#P<0.05)；且与H+LWDH组相比，LWDH+3-MA组自噬相关蛋白Beclin 1表达明显下调(▲P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值有降低趋势，差异无统计学意义。说明在氧化应激条件下成骨细胞自噬水平降低，而LWDH含药血清可以促进氧化应激状态下成骨细胞的自噬水平。见图5。

图5 蛋白印迹法检测Beclin 1、LC3B 蛋白表达情况Fig.5 Western blotting assay for Beclin 1 and LC3B protein expression注：A：Control组；B：Model组；C：H+Blank组；D：H+LWDH组；E：LWDH+3-MA组。与Control组相比，#P<0.05；与Model组相比，*P<0.05；与H+LWDH组相比，▲P<0.05。

3 讨论

研究发现[13]，绝经期女性由于年龄的增长，机体的雌激素水平会逐渐降低、抗氧化能力减弱、氧化酶活性增加，最终会诱导机体发生氧化应激反应。机体内ROS不断堆积，会对胞膜及胞核中的脂质、蛋白质和DNA等物质造成损伤，这不仅会使成骨细胞的活性降低，还会导致成骨细胞凋亡增多，最终导致骨代谢的失衡、骨密度的降低[14-15]。本研究发现，H2O2会明显提高MC3T3-E1成骨细胞的ROS水平，可模拟细胞处于氧化应激状态，且对细胞增殖具有明显的抑制作用；而六味地黄丸含药血清可以降低氧化应激状态下细胞内ROS水平，减轻细胞氧化损伤，以促进细胞的增殖。

研究显示[16]，在多种毒性条件下，如氧化应激状态下，自噬对成骨细胞都具有保护作用，并且深度参与了体内多种生物信号介导的成骨分化[17]。目前的研究证明[18-19]，氧化应激和自噬之间具有复杂的相互作用关系，机体内过多的ROS能诱导自噬发生，而细胞自噬的激活，可以通过降解胞内受损的细胞器、蛋白质等来降低机体的ROS水平，以调节氧化/抗氧化平衡。影响细胞自噬发生过程最关键的是自噬小体的形成，同时也受到很多自噬相关基因，比如LC3、Beclin 1等的调控。其中LC3有两种亚型，当激活细胞自噬后，LC3-Ⅰ型会迅速转换成LC3-Ⅱ型，因此机体内LC3-Ⅱ的表达量可以作为自噬小体形成的标志之一[20]。Beclin l可以通过与分隔膜结合形成成熟的自噬小体[21]，因此Beclin l的表达水平与自噬水平呈正相关，被认为是自噬的正向调节因子，若Beclin l的表达增多，则可以说明自噬被激活。本研究发现，H2O2会降低成骨细胞Beclin 1、LC3B mRNA的表达、降低Beclin 1蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值；而六味地黄丸含药血清可以提高氧化应激状态下成骨细胞Beclin 1、LC3B mRNA的表达、提高Beclin 1蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值，且在加入自噬抑制剂3-MA后，该作用被抑制。说明六味地黄丸含药血清减轻氧化应激状态下的MC3T3-E1成骨细胞的氧化损伤的机制可能是诱导细胞自噬。

综上所述，六味地黄丸含药血清减轻MC3T3-E1成骨细胞的氧化应激损伤以促进细胞的增殖，可能是通过诱导细胞自噬来实现的。目前研究发现[22-24]，细胞自噬具有双重作用，在正常生理状态下细胞保持着基础水平的自噬，当氧化应激程度超过机体的可控范围时，无法被清除的ROS会激活自噬的相关通路使自噬过度，以出现细胞自我消化现象，最终导致细胞死亡，这被称为依赖ROS的自噬性死亡途径，目前该死亡途径在众多肿瘤细胞系中已得到证实。六味地黄丸如何调控成骨细胞自噬处于可控范围内，以抵抗细胞的氧化应激损伤还需要进一步研究。