高职药学专业教材中色谱分析的实验设计研究——以《板蓝根分离及鉴定的薄层色谱》为例

庞 键，吴 陵，程 正，郑如程

（1.铜陵职业技术学院，安徽 铜陵 244000；2.铜陵市食品药品检验中心，安徽 铜陵 244000）

高职院校《分析化学》（人民卫生出版社）[1]教材中薄层色谱法的实验是对磺胺类药物进行分离及鉴定。 因实验过程中需使用到三氯甲烷和丙酮等有毒化学品， 具有较高的安全风险， 且实验步骤较为繁琐， 导致最终实验重现效果不理想。 所以自行设计一个便捷高效， 效果明显的薄层色谱法实验非常有必要。

板蓝根（Radix Isatidis）为临床上常用的传统中药，为十字花科植物菘蓝（Isatisindigotica Fort）的干燥根， 具有清热解毒、 凉血消肿利咽、 抗钩端螺旋体、抗菌、抗炎和增强免疫力等作用。 板蓝根中化学成分主要含有靛玉红、靛蓝、蒽醌类、β-谷甾醇、γ-谷甾醇及多种氨基酸等， 其中靛玉红、 靛蓝为其主要的有效、 有色成分。 靛玉红为双吲哚类抗肿瘤药物，对宫颈癌、肝癌、淋巴瘤、肝门胆管癌及早幼粒白血病均具有显著的抑制作用[2]。 靛蓝具有抗菌抗氧化的作用，主要用于温病热盛，斑疹，咯血，咽痛口疮，小儿惊痫，疮肿，丹毒，蛇虫咬伤等。 研究表明，靛蓝和靛玉红是同分异构体， 两者既是外源性又是内源性的芳烃受体(AHR)配体，AHR 广泛表达于肠道免疫和非免疫细胞，在炎症、免疫、组织修复中发挥重要作用[3]。

薄层色谱法是一种将固定相均匀涂铺在光洁表面的玻璃、金属板等上面形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的平面色谱方法。 其具有设备简单、 速度快、分离效果好、灵敏度高、直观、经济等特点，且可同时分离多个样品，是一种微量的分离分析方法。薄层色谱鉴别作为中药尤其是中成药鉴别的首选方法。 在 2020 年版《中国药典(一部)》[4]的应用研究较多， 在非法添加化学药品的筛查方面也有着不可或缺的地位。 近年来，随着新材料、新技术的应用，薄层色谱技术已由传统的普通薄层色谱发展到高效薄层色谱（HPTLC）、微乳薄层色谱（METLC）[5-7]、胶束薄层色谱（MTLC），并逐步向联用检测方向发展如薄层色谱-质谱联用等有效的定性分析手段，从而实现优势互补。随着新技术的应用，中药薄层色谱鉴别方法指向的鉴别成分也将更加明确， 质量控制模式更加绿色环保[8]。

本实验以板蓝根为研究对象， 以薄层色谱法对板蓝根中的靛蓝和靛玉红进行分离和鉴定。 通过本实验确定最佳分离条件，使之具有简便高效、安全低毒等特点， 为高职院校学生实验教材的编写提供了参考和实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

XSE205 型电子天平 (瑞士梅特勒- 托利多集团，0.1mg/0.01mg)，Linomat5 型半自动点样仪 (瑞士卡玛)，Goodlook-2000 薄层成像仪 (上海科哲)，H 型薄层层析板 （烟台德信生物科技有限公司,10*10cm），H 型薄层层析板 （德国默克，10*10cm），KH5200B 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），IKA A11 研磨粉碎机。

1.2 试药

板蓝根 (安徽宏坤药业有限公司， 批号为210201)，靛蓝对照品(上海安谱璀世标准技术服务有限公司，批号为 2252186，含量为98.8%)，靛玉红对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110717-202106，含量为99.1%)，其余试剂均为分析纯，试验用水由Milli-Q 系统制备。

2 方法与结果

2.1 实验流程

溶液配制→点样→展开显色→斑点定位→定性鉴别。 《中国药典(四部)》（2020 年版）[9]中，以比移值Rf作为薄层色谱法系统适用性试验的考察指标，通过计算比移值Rf(原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值) 并比较供试品与对照品的Rf值，从而进行定性鉴别。比移值Rf应在0-1 之间，可用范围是0.2-0.8，最佳范围是0.3-0.5。

2.2 溶液制备

供试品溶液：称取板蓝根10g，粉碎，加乙酸乙酯40mL，超声处理(功率 250W，50kHz)30min，静置，取上清液，水浴蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL，微热使溶解，放冷。

对照品溶液： 分别称取靛玉红对照品和靛蓝对照品适量，加乙酸乙酯溶解，稀释成每1mL 分别含靛玉红和靛蓝各0.2mg 的溶液，即得。

2.3 展开剂条件优化

《中国药典(四部)》（2020 年版）[9]中明确说明：展开剂的选择是薄层分离结果优劣的重要条件之一。 展开剂选择和优化主要考虑溶剂的极性和溶剂的选择性两个方面， 以达到比移值Rf在0.2-0.8 范围内的要求，并达到最佳分离效果。展开剂均需预饱和20min，同时尽可能选择较小容积的层析缸，缸口需磨砂盖面密封，置阴凉处，避免产生边缘效应。 本实验依据展开剂的极性大小，分别采用石油醚（60-90℃）、乙酸乙酯、丙酮-无水乙醇-盐酸(10:6:1)、石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05)为展开剂，在相似的温度与湿度条件下，分别进行薄层色谱实验，点样量均为10μL，点样顺序为供试品溶液、供试品溶液、供试品溶液、靛玉红对照品溶液和靛蓝对照品溶液，结果见图1-4。

图1 (展开剂：石油醚（60-90℃）)

图2 (展开剂：乙酸乙酯)

图3 (展开剂：丙酮-无水乙醇-盐酸(10:6:1))

图4 (展开剂：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05))

由色谱图可知；采用石油醚（60-90℃）为展开剂时，供试品溶液和对照品溶液均无斑点；采用乙酸乙酯为展开剂时， 供试品溶液中靛玉红和靛蓝特征斑点Rf偏高，靛玉红对照品有拖尾现象；采用丙酮-无水乙醇-盐酸(10:6:1)为展开剂时，靛蓝对照品溶液特征斑点不清晰，且在靛玉红特征斑点处有干扰，靛玉红对照品有拖尾现象， 靛玉红和靛蓝特征斑点Rf偏高；采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05)为展开剂时，供试品溶液中靛蓝和靛玉红特征斑点均有拖尾现象， 靛蓝对照品溶液的特征斑点较清晰；故在展开剂的选择上仍需进一步优化。采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2)为展开剂时， 供试品及靛蓝对照品溶液中靛蓝和靛玉红特征斑点清晰，靛玉红对照品拖尾现象不明显，靛玉红特征斑点Rf在0.5-0.58 之间， 靛蓝特征斑点Rf在0.72-0.75 之间，结果见图5，故展开剂采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2)时分离效果最佳。

图5 (展开剂：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2))

2.4 点样量条件优化

点样是薄层色谱分析的重要环节，尤其是在定性鉴别中，点样量的大小对检测结果具有直接影响。点样量太小，不能检出清晰的斑点影响判断；点样量太多，展开剂不能全部负载，容易产生拖尾现象。 本实验以石油醚 (60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)为展开剂，点样量分别为 20μL、10μL、5μL，在相似的温度与湿度条件下，分别进行薄层色谱实验，考察点样量对色谱结果的影响， 点样顺序为供试品溶液、供试品溶液、供试品溶液、靛玉红对照品溶液和靛蓝对照品溶液，结果见图6-8。

图6 （点样量 20μL）

图7 （点样量 10μL）

图8 （点样量 5μL）

由色谱图可知：点样量为20μL 时，供试品溶液及靛玉红对照品溶液特征斑点均出现拖尾现象；点样量为10μL 时，靛玉红对照品溶液出现拖尾现象，比移值 Rf值在 0.5-0.7 之间； 点样量为 5μL 时，特征斑点不够清晰，且同样存在拖尾现象。故选择点样量为 10μL 较为合理。

2.5 温湿度条件优化

在薄层色谱鉴定过程中， 温度和湿度是影响薄层色谱鉴定效果的重要因素。 在其他条件相同的情况下， 实验环境的相对湿度对薄层板的活性有直接影响，对色谱质量影响明显。 薄层板常常需在105-110℃活化，使水合硅醇基变为游离硅醇基[10]。 大多数成分对相对湿度有较宽适应性， 但有部分样品在不同湿度环境中，分离效果有较明显变化[11]；当温度较高时，薄层色谱的特征斑点的Rf值较高，检查准确性降低。因在展开的过程中，较高的温度也会造成展开剂中的有机溶剂蒸发加速， 导致展开缸中的多元溶剂蒸气比例发生转变，造成展开效果出现差异。以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)为展开剂，点样量分别在不同的温湿度条件下进行薄层色谱实验，考察温湿度对色谱结果的影响，点样顺序为供试品溶液、供试品溶液、供试品溶液、靛玉红对照品溶液和靛蓝对照品溶液，结果见图9-13。

图9 (温度 4℃，湿度 40%)

图10 (温度 15℃，湿度 60%)

图11 (温度 22℃，湿度45%)

图12 (温度 20℃，湿度40%)

图13 (温度 20℃，湿度45%)

由色谱图可知： 在温度4℃， 湿度40%条件下时，各特征斑点Rf值均较好，但靛蓝对照品溶液特征斑点不够明显， 且存在干扰和拖尾现象； 在温度15℃，湿度60%条件下时，各特征斑点清晰，靛玉红特征斑点Rf值小于0.7， 靛蓝特征斑点Rf值稍高；温度22℃，湿度45%时，靛玉红特征斑点Rf值大于0.65，靛蓝特征斑点Rf值大于0.8，温湿度条件仍需进一步优化。当温度20℃，湿度40%时，靛玉红特征斑点Rf值小于 0.6，靛蓝特征斑点Rf值小于0.8；当温度20℃，湿度45%时，靛玉红特征斑点Rf值小于0.6，靛蓝特征斑点Rf值接近0.72。 可见温度偏高对比移值Rf或有影响， 温度偏低对分离效果或有影响；而从图9、图11、图12 中的比移值 Rf表征，有效成分对相对湿度有较宽适应性。 故选择温度在温度15-20℃，湿度40%-60%较为合理。

2.6 薄层层析板的选择

由于不同组分在不同薄层层析板上的吸附和解吸能力不同，因此它们在移动过程中会出现不同程度的分配过程，从而实现分离。 而不同品牌的薄层层析板因所用硅胶的粒度和粘合度不同，薄层色谱行为和分离效果也会存在一定的差异。本实验分别采用烟台H 型和德国默克H 型薄层层析板进行实验， 以石油醚 (60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)为展开剂，点样量为 10μL，温度 15℃，湿度60%，点样顺序为供试品溶液、供试品溶液、供试品溶液、靛玉红对照品溶液和靛蓝对照品溶液，结果见图14-15。

图14 (烟台H 型薄层板)

图15 (德国默克H 型薄层板)

由色谱图可知，采用烟台H 型薄层板时，靛蓝特征斑点较为模糊， 靛玉红特征斑点Rf值偏高；采用德国默克H 型薄层板时，各特征斑点清晰，靛玉红特征斑点Rf值小于0.6，靛蓝特征斑点Rf值约为0.7。 故以使用德国默克H 型薄层板为宜。

2.7 最终优化色谱条件

综上所述，当温度为15-20℃，湿度40-60%时，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)为展开剂，点样量10μL，采用德国默克H 型薄层板，点样顺序为供试品溶液、供试品溶液、供试品溶液、靛玉红对照品溶液和靛蓝对照品溶液， 进行薄层色谱实验。 结果见图16。 供试品溶液与对照品溶液各特征斑点清晰、无拖尾现象，Rf值均在在0.5-0.7 范围内，具有较好的分析效果。

图16

2.8 结果

综上所述，所采用的实验方法专属性强、灵敏度高，简便高效，安全低毒。 板蓝根中的靛玉红和靛蓝的薄层色谱具有鉴别特征， 用于板蓝根中的靛玉红和靛蓝的定性鉴别是切实可行的。 本项研究也为高职院校学生实验教材的编写提供参考数据和扎实可靠的实验依据。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

待分离鉴定成分在提取溶剂中的溶解度大小会对薄层色谱结果造成一定影响。溶解度过大，点样时原点会变成空心圆，影响随后的线性展开；溶解度过小，浓度过低，展开后薄层色谱图不够清晰。 所以原则上应选择对待分离鉴定成分可以溶解但溶解度适中的溶剂。石油醚作为极性较小的有机溶剂，若选择石油醚(30-60℃)，则易挥发，损失较大；靛玉红溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，不溶于水，微溶于乙醇；靛蓝微溶于水、乙醇、甘油、乙酸乙酯和丙二醇，不溶于油脂[4]；少量三乙胺通过实验表征起着防拖尾的作用。 故在本实验中对板蓝根中的靛玉红和靛蓝进行提取时，选择石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和三乙胺组合的多元展开剂作为提取溶剂。

3.2 点样方式与方法的选择

薄层色谱分析中的点样方式分为手动点样和自动点样。手动点样主要器具为微量毛细管、微量注射器等，点样方法为接触式点样。自动点样采用半自动或全自动点样仪，按预设程序自动点样，点样方法以喷雾点样较为多见。手动点样灵活方便，常用于各种薄层色谱鉴别中，点样器具以微量毛细管为主；仪器的自动点样准确性高， 常用于薄层扫描法的含量测定。 因本实验是对板蓝根中的靛玉红和靛蓝进行定性鉴别， 且考虑到在日常的高校实验教学中采用全自动或半自动点样仪会降低实验效率， 难以对学生的动手能力进行考查等因素， 故本实验大多采用了接触式的手动点样方法， 同时考虑到提取溶剂的挥发性，一般采用洗耳球轻吹，反复手动点样。

3.3 薄层板的选择

本实验中分别采用了烟台H 型薄层板和德国默克H 型薄层板对靛玉红和靛蓝进行分离鉴定。 实际完成的薄层色谱图中，烟台H 型薄层板上靛蓝特征斑点Rf较大， 且靛玉红特征斑点存在一定的拖尾， 但靛蓝与靛玉红已实现完全分离。 考虑到德国默克H 型薄层板成本较高，故在日常的高校实验教学中也可使用烟台H 型薄层板。

3.4 与磺胺类药物的薄层色谱分离及鉴定实验的比较

在高职院校《分析化学》（人民卫生出版社）教材《磺胺类药物的薄层色谱分离及鉴定》 的实验中，使用了丙酮作为磺胺类特征成分的提取溶剂， 在展开剂中使用了三氯甲烷作为展开溶剂。 根据 《危险化学品安全管理条例》 和 《易制毒化学品管理条例》，丙酮和三氯甲烷分别属于易制毒第三类和第二类化学品，受公安部门管制，且三氯甲烷已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入2B 类致癌物清单[12]。 两者的存放场所必须安全可靠， 且有专人保管。 故在日常的实验教学中， 实验过程中严格按照操作程序和要求进行操作， 对实验试剂的使用保管以及学生的管理提出较高的要求。 本实验过程中使用的溶剂为石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和三乙胺，均不属于易制毒化学品，且毒性较低，整个实验过程更加安全环保。