细胞块联合免疫组化检测对胸腔积液中腺癌与间皮的鉴别作用

顾婷婷 姚丽倩 徐 松 高小姣

江苏大学附属昆山医院 昆山市第一人民医院病理科，江苏昆山 215300

胸腔积液常是晚期恶性肿瘤的首发症状[1-2]。恶性胸腔积液最常见于肺癌中晚期患者，也包括其他脏器恶性肿瘤的远处转移、原发于胸膜的恶性胸膜间皮瘤等[3-4]。目前，细胞病理学检查仍然是恶性胸腔积液常用诊断方法[5-6]。常规细胞学涂片质量差，细胞数量少，诊断经验不足等因素均可导致阳性检出率低[7]。胸腔积液中反应性增生的间皮细胞形态与腺癌细胞常难以区分，造成漏诊甚至误诊[8]。本研究对可疑异型腺上皮的169例胸腔积液标本进行了细胞块包埋及石蜡切片，并应用一组抗体进行免疫组化染色，以探讨细胞蜡块结合免疫组化在胸腔积液细胞病理学诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2017年1月至2020年5月昆山市第一人民医院病理科有转移性腺癌及反应性增生的间皮细胞的胸腔积液标本169例，男98例、女71例；年龄19～93岁。选取的恶性胸腔积液病例均经过常规细胞学诊断，且与临床诊断或原发灶组织病理学诊断相符。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及试剂 HE染色机（ST5020，德国LEICA公司）。全自动免疫组化染色机（LEICA BOND-MAX，德 国LEICA公 司）。特 异性一抗试剂：波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白5/6（cytokeratin，CK5/6）、肾母细胞瘤基因（nephroblastoma gene，WT-1）、钙 网 膜 蛋 白（Calretinin）、癌 胚 抗 原（carcino-embryonic antigen，CEA，细胞角蛋白7（cell keratin 7，CK7）、人类全癌上皮相关糖蛋白2（human pancarcinoma-associated epithelial glycoprotein-2，MOC-31）、上皮特异抗原（Ber-Ep4）均购自上海基因科技有限公司。免疫显色试剂（徕卡生物系统有限公司）。

1.2.2 细胞石蜡制片及染色 将存档的胸腔积液倒入50 ml离心管中，2500 r/min，离心10 min，弃去上清液，根据沉淀量加入2倍体积的95%乙醇，2500 r/min，离心10 min，弃去上清液，取出沉淀物放入包埋盒，10%中性甲醛固定后，进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成细胞石蜡块。常规石蜡切片3～4 μm，烘箱65℃烤片60 min备用。

每例标本选取一张常规切片脱蜡，进行苏木素伊红（HE）染色，中性树胶封片。选用特异性一抗试剂行全自动免疫组化（IHC）染色机染色，严格按说明书步骤操作。

1.3 结果判定

免疫组化结果均由两名高年资病理医师进行双盲独立阅片。Vimentin、CK7、CK5/6定位于胞质，WT1定位于胞核，MOC-31、Calretinin定位于胞核和胞质，CEA、Ber-Ep4定位于胞膜和胞质。细胞着色定位明确，呈棕黄色颗粒为阳性细胞。

1.4 统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行处理，计数资料采用χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胸腔积液的石蜡包埋切片HE染色特点

镜下观察，82例恶性胸腔积液为腺癌细胞，细胞核偏位，呈圆或椭圆形，核浆比高，核染色质粗颗粒状。细胞平铺排列，部分细胞呈巢状立体结构，外观呈球形、乳头状、或腺腔样结构，其中以腺腔样结构常见，背景为数量不等的红细胞、间皮细胞、淋巴细胞及炎细胞（图1A）。38例间皮反应性增生的病例中，增生的间皮细胞，核略增大、深染，核质比略增大，细胞呈类圆形、梭形、多边形等多种形态，有聚集成团倾向，细胞团细胞之间常见“开窗”现象（图2A）。49例为难以鉴别为转移性腺癌、反应性增生的间皮细胞或间皮瘤。

图1 腺癌细胞HE及免疫组化染色

2.2 免疫组化结果分析

2.2.1 腺癌细胞与反应性间皮细胞免疫组化结果 细胞蜡块连续切片，免疫标记的染色背景清晰、阳性染色细胞定位准确，易于判断。腺癌细胞的HE染色及抗体着色情况（图1）。反应性增生的间皮细胞HE染色及抗体着色情况（图2）。CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在转移性腺癌和增生间皮细胞中的表达有显著差异（表l）。CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4在腺癌中的阳性表达率分别为81.0%、66.7%、90.5%、81.9%；而在增生性间皮中，阳性表达率仅为6.3%、12.5%、4.7%、7.8%。Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在增生性间皮中，阳性表达率分别为87.5%、84.3%、92.2%、90.6%；而在转移性腺癌中，阳性表达率仅为28.6%、17.1%、14.3%、4.8%。

图2 间皮细胞HE及免疫组化染色

表1 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在腺癌与间皮源性细胞的表达结果

2.2.2 联合免疫标记 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1及Calretinin在转移性腺癌与增生性间皮细胞中的敏感度与特异度（表2）。

表2 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在鉴别诊断腺癌细胞与增生性间皮细胞中的应用价值（%）

3 讨论

胸腔积液（胸水）主要指人体胸膜腔中病理性液体积聚，常为晚期恶性肿瘤患者出现的首发症状，尤其是肺癌患者[9-10]。因此，胸水性质的病理学诊断极其重要[11]。传统胸水离心细胞涂片简单、经济[12]，但阳性检出率低。细胞块石蜡技术可提高检出细胞数量，避免细胞形态破坏[13]，还能实现切片长期保存，用于免疫组化、基因检测等进一步检查[14-15]。而常规细胞涂片中增生性间皮与腺癌细胞常难以鉴别[16]。此时，联合细胞块石蜡技术与免疫组化检测，不仅明显提高阳性细胞检出率，也解决了一部分疑难病例。文献表明，完成这一任务还需要多个抗体联合应用、相互补充[17-19]。

本研究对169例胸水离心沉淀行细胞块石蜡包埋，采用Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin、CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4一组联合抗体，应用于胸水细胞学诊断与鉴别诊断。结果显示，CEA标记腺癌细胞的敏感度为81.0%，特异度为93.8%，标记间皮细胞阳性率仅为6.3%。CEA是对间皮和癌细胞实施区分的有效标记，广泛存在于各种腺上皮源性肿瘤中，尤其是各种腺癌细胞中，而在间皮细胞以及间皮瘤中，并不存在CEA表达。CK7主要在移行上皮及正常组织腺上皮标记，非上皮来源不表达，本组CK7在腺癌中的敏感性为66.7%，特异性为87.5%。MOC-31又称做EGP-2（上皮糖蛋白-2），是上皮的分子标记，非上皮来源不表达，因此MOC-31有助于确定胸水细胞来源。本组MOC-31在腺癌中的敏感性为90.5%，特异性为95.3%，在增生性间皮中表达极低。Ber-Ep4除了表层鳞状上皮、肝细胞和壁细胞外，所有上皮都表达，而间皮通常不表达。本组Ber-Ep4在腺癌中的敏感性为81.9%，特异性为92.2%。且CEA、CK7、Ber-Ep4、MOC-31在腺癌组与增生性间皮组之间的表达存在显著差异，提示这一组联合抗体是识别腺癌细胞的有效标志物。

Vimentin可用作上皮源性与间叶源性肿瘤、子宫内膜腺癌与宫颈腺癌、间皮与腺癌细胞的鉴别诊断等。在本组胸水中标记间皮的敏感性为87.5%，特异性为71.4%。CK5/6为高分子量角蛋白，正常组织中表达在皮肤的基底和棘层细胞，部分前列腺基底细胞，导管上皮的基底细胞以及部分鳞状上皮生发层、肌上皮和间皮，腺上皮不表达。因此，可用于鳞癌和腺癌，间皮和腺癌细胞的鉴别诊断。本组CK5/6标记间皮的敏感性为84.3%，特异性为82.9%。WT1正常表达于肾、支持细胞、子宫蜕膜细胞及卵巢颗粒细胞等，在Wilm’s瘤，后肾腺瘤及间皮中常阳性表达，可作为间皮与腺癌细胞的鉴别诊断。本组WT1标记间皮的敏感性为92.2%，特异性为85.7%，在转移性腺癌中表达极少。Calretinin是一种钙结合蛋白，存在于神经元及其他细胞中，间皮中亦有表达，而腺癌极少表达，它是鉴别恶性间皮瘤最特异性的标志物。本组Calretinin标记间皮的敏感性为90.6%，特异性高达95.2%。且Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在增生性间皮组与腺癌组之间的表达存在显著差异，提示这一组联合抗体是识别间皮的有效标志物。

因此，采用细胞块石蜡技术联合免疫组化能够有效协助临床病理医师对疾病更准确地诊断，Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin、CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4这组联合抗体在胸水转移性腺癌与增生性间皮细胞中的表达差异均有统计学意义，但各个抗体的敏感性和特异性也存在不同程度的局限性，联合抗体检测可大大提高其实际应用价值，值得在临床中推广使用。