HPLC法同时测定美洲大蠊标准汤剂中6种成分含量

吴津丽 高 晗 曾永祯 吴清雨 陈博涛 李军山,2,3 王亚涛 董博宇 张睿智 孙福仁*

1.神威药业集团有限公司,河北 石家庄 051430;2.楚雄神威施普瑞药物研究有限公司,云南 楚雄 675000; 3.云南省中药配方颗粒工程研究中心,云南 楚雄 675000

美洲大蠊为蜚蠊科昆虫美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全体。本品味咸，性寒，入心、肝、脾、肾经。具有健脾消疳，活血通脉，利水消肿，敛疮生肌的功效。内用治疗胁痛、癥瘕、疳积、心悸、气喘、水肿；外用治疗水火烫伤、各种创伤及溃疡[1]。美洲大蠊药材分布广泛[2]。其富含蛋白质、脂肪酸、核苷类、多糖、昆虫神经肽、异黄酮、油脂等多种化学成分[3-8]。

核苷类物质是构成RNA和DNA的前体物质，也是抗肿瘤和抗病毒药物的中间体[8]。核苷类物质检测是美洲大蠊药材及加工品检测的主要指标，温慧敏等[9]采用HPLC法测定美洲大蠊饮片中尿嘧啶、肌苷的含量；黄博等[10]利用HPLC法同时测定美洲大蠊药材中尿嘧啶、肌苷、次黄嘌呤三种成分；赵从琪等[11]对美洲大蠊药材脱脂处理并测定5种核苷类成分；马雪伟等[12]建立HPLC法测定美洲大蠊提取物冻干粉中9种核苷类成分。上述文献的研究对象集中于美洲大蠊药材及其提取物，尚未有关于美洲大蠊标准汤剂的相关报道。本文以不同产地的美洲大蠊饮片为原料，制备了10批美洲大蠊标准汤剂。采用HPLC法同时测定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸6种成分含量，为美洲大蠊配方颗粒质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 WATERS Symmetry Shield C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；岛津高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-M20A型检测器，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，岛津LabSolutions色谱工作站；CPA225D型电子分析天平(北京赛多利斯)；JM-A5002型电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司)；KH-7200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；R502B旋转蒸发仪(上海申科生物技术有限公司)；LGJ-12压盖型真空冷冻干燥机(河南兄弟仪器设备有限公司)；荣事达养生药膳壶(合肥荣事达小家电有限公司)；0.45 μm有机系/水系针头式滤器(ASC，AMERICAN SCIENTIFIC)；

1.2 对照品 尿嘧啶(上海源叶生物科技有限公司，批号：T14A8X33880，纯度≥98%)；尿苷(中国食品药品检定研究院，批号：110887-202104，纯度为99.6%)；鸟苷(中国食品药品检定研究院，批号：111977-201501，纯度为93.6%)；次黄嘌呤(乐美天医药/德思特生物，批号：DST200305，纯度≥98%)；肌苷(中国食品药品检定研究院，批号：140669-202007，纯度为99.2%)；原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201906，纯度为97.7%)。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)均为HPLC级(美国ACS公司)；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

1.3 药材来源及标准汤剂制备方法

1.3.1 药材 10批美洲大蠊饮片来源于云南、四川、安徽、山东4个产区，经原河北省药品检验所孙宝惠老师鉴定，为蜚蠊科昆虫美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全体。

1.3.2 标准汤剂 根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》中相关规定，确定美洲大蠊标准汤剂制备工艺为：取饮片100 g，加水煎煮二次，一煎加8倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮30 min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮20 min，200目筛网过滤，合并两次煎液，立即冷却至室温，低温真空浓缩，浓缩液冷冻干燥，密封包装，即得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 WATERS Symmetry Shield C18(柱长为250 mm，内径为4.6 mm，粒径为5.0 μm)；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，梯度洗脱(0～9 min，0%～0%A；9～10 min，0%～2%A；10～15 min，2%～2%A；15～20 min，2%～5%A；20～35 min，5%～6%A；35～55 min，6%～10%A；55～60 min，10%～11%A)；柱温20℃；体积流速0.6 mL/min；进样量10 μL；检测波长为254 nm。理论板数按肌苷峰计算应不低于10000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸对照品2.13 mg、8.11 mg、4.20 mg、11.54 mg、6.76 mg、13.70 mg，分别置于25 mL、10 mL、25 mL、10 mL、50 mL、25 mL容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，制成储备液。再精密量取各成分储备液4 mL、1 mL、1 mL、2 mL、1 mL、2 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，制成每 1 mL含尿嘧啶13.63 μg、次黄嘌呤32.44 μg、尿苷6.72 μg、肌苷92.32μg、鸟苷5.41 μg、原儿茶酸43.84 μg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取美洲大蠊标准汤剂粉末，精密称取0.5 g，置25 mL量瓶中，加入适量30%甲醇(V/V)，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，用30%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 取30%甲醇(V/V)适量，加入25 mL量瓶中，用30%甲醇(V/V)定容至刻度，即得阴性样品溶液。

2.5 专属性实验 分别吸取对照品溶液、供试品、阴性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定。结果显示，供试品溶液在与尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸对照品的相同保留时间处有色谱峰，而阴性样品溶液中未见色谱峰，表明其对测定结果无干扰，且样品中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸色谱峰分离度均大于1.5，符合含量测定要求。如图1所示。

(A)对照品溶液

(B)阴性对照

(C)美洲大蠊标准汤剂样品1.尿嘧啶；2.次黄嘌呤；3.尿苷；4.肌苷；5.鸟苷；6.原儿茶酸图1 含量测定色谱图

2.6 线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液3 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，在“2.1”项色谱方法下测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表1，各成分在各自规定范围内线性关系良好。

表1 线性范围及回归方程表

2.7 精密度试验 在“2.1”项色谱条件下，精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定、记录峰面积积分值。经计算，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸峰面积RSD值分别为0.78%、1.15%、0.85%、0.21%、0.46%、0.55%，结果说明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取同一批美洲大蠊标准汤剂S10干膏粉适量，分别称取6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件测定，测得供试品溶液中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸含量的RSD值分别为0.91%、1.42%、0.98%、1.12%、0.77%、1.24%(n=6)，说明方法重现性良好。

2.9 稳定性试验 取美洲大蠊标准汤剂S10干膏粉适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定，测得尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸含量的RSD值分别为1.24%、1.75%、1.64%、1.57%、1.28%、0.94%(n=6)，表明供试品在溶液状态下24 h内基本稳定。

2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的美洲大蠊标准汤剂干膏粉(S10)0.25 g，置于25 mL容量瓶中，共计6份，分别精密加入等量尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸对照品溶液，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项色谱条件测定，分别计算尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸回收率。测定结果见表2。

表2 加样回收率试验结果表

2.11 样品测定 取10批美洲大蠊标准汤剂干膏粉适量，按照“2.3”项下制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，计算含量。结果见表3。

表3 10批美洲大蠊标准汤剂含量测定结果表 (mg/g)

由表3可知，不同产地美洲大蠊标准汤剂中6种成分的含量测定值有一定差异。根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》中相关要求，以10批标准汤剂中6种成分测定值均值加减30%范围为限度，评价10批标准汤剂是否有异常值。

10批美洲大蠊标准汤剂中肌苷成分含量范围为2.17～3.15 mg/g，平均含量为2.63 mg/g，SD为0.36，RSD为13.69%。肌苷含量平均值的70%～130%的范围为1.84～3.42 mg/g，10批美洲大蠊标准汤剂中肌苷含量处于规定范围内，没有异常值。其余5种成分含量值范围同样处于均值的70%～130%范围内。

3 讨论

本文以美洲大蠊饮片，根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》中相关规定制备了10批美洲大蠊标准汤剂，制定含量测定方法，测定6种成分的含量。

3.1 色谱柱考察 本文以美洲大蠊标准汤剂中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸6种成分为分析对象。通过色谱柱筛选，发现WATERS Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱适合美洲大蠊标准汤剂中极性成分的分析，该色谱柱能够耐受100%水相，且在水相比例大于95%的条件下，对待分析成分仍有分离作用，因此，确定使用WATERS Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

3.2 流动相考察 考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸不同种类的流动相系统，结果表明：采用甲醇-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱时，6个待测成分色谱峰峰形较好，分离度高，因此，选择甲醇-0.1%磷酸为流动相系统。

3.3 柱温考察 分别设定柱温为20 ℃、25 ℃、30 ℃测定供试品中待测成分含量，结果表明，柱温设定20 ℃时，6种待测成分分离度达到含量测定要求，因此，确定柱温为20 ℃。

3.4 检测波长考察 通过PDA检测器210～400 nm全波长扫描，发现波长设定254 nm时，各色谱峰数量、分离度均较好，能够反映出美洲大蠊中水溶性成分的多样性，所以选择254 nm作为检测波长。

3.5 供试品溶液制备考察 供试品溶液的提取溶剂分别考察采用水及30%、50%、70%甲醇，结果发现30%甲醇为溶剂时，6种待测成分含量最高，故选择30%甲醇为提取溶媒。

4 结语

本文以美洲大蠊饮片为原料，按照标准汤剂制备方法制备了10批美洲大蠊标准汤剂。应用HPLC液相色谱法建立美洲大蠊标准汤剂的含量测定方法，可同时测定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸6种成分。6种成分均属于水中溶解度较高的成分，符合美洲大蠊标准汤剂以水为提取溶媒的制备特点。其中，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷为核苷类成分。经方法学考察，各色谱峰分离度均达到1.5以上，线性、加样回收率等均符合含量测定要求。

美洲大蠊标准汤剂含量测定方法的建立可为美洲大蠊配方颗粒质量控制提供参考。且本文在文献资料的基础上，重新建立含量测定方法，同时测定6种化学成分，质量控制更加全面。