黄芪注射液对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2细胞凋亡的抑制作用和机制研究

程炜婷，张 婷，金秋硕，马 喆，吴爱明，薛程元，高永红，聂 波，赵明镜，娄利霞

心力衰竭(heart failure，HF)是各类心血管疾病发展的终末阶段和主要死因，具有发病率高、病死率高的特点。心力衰竭时，心肌细胞缺血、缺氧，线粒体结构和功能发生改变，可导致心肌细胞能量代谢紊乱，引起心肌代谢重构和最终细胞死亡[1]。线粒体内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)是内质网与线粒体间的结构耦联，在钙(Ca2+)信号传导、脂质运输、能量代谢和细胞存活中起着关键作用。新近研究证实MAM结构在心力衰竭的病理过程中发挥尤为重要的作用[2]。心力衰竭属于中医学“胸痹”“心悸”等范畴。《素问·逆调论篇 》：“若心气虚衰，可见喘息持续不已”，由此认为心气虚是心力衰竭的内因，是病理基础。故补益心气是心力衰竭治疗的治本之法。黄芪为临床常用的益气药，在用益气法治疗心力衰竭过程中发挥着重要作用[3]。本研究采用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导H9c2细胞凋亡模型，通过黄芪注射液干预，探讨黄芪注射液是否通过调节MAM结构蛋白电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1，VDAC1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn2)及分子伴侣葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75，GRP75)的表达来抑制AngⅡ诱导的H9c2细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠H9c2心肌细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所国家实验细胞资源共享服务平台；DMEM培养基、胎牛血清以及胰蛋白酶购自美国Gibco公司；AngⅡ(ANGT-003)购自中国杭州中肽生化有限公司；黄芪注射液(国药准字Z13020999)购自神威药业集团有限公司；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测试剂盒(CK04)购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；动物组织RNA提取试剂盒(DP431)、反转录试剂盒(K1622)、扩增试剂盒(FP205-02)购自北京天根生化科技有限公司，所用引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(10149-1-AP)、Mfn2抗体(12186-1-Ap)购自美国Proteintech公司；VDAC1抗体(Ab14734)、GRP75抗体(Ab2799)购自美国Abcam公司；全蛋白提取试剂盒(KGP250)与二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量检测试剂盒(KGP902)购自江苏凯基技术生物有限公司；羊抗兔(A0208)、羊抗小鼠(A0216)、Fura-2AM试剂盒(S1052)购于上海碧云天生物技术有限公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(556547)购自美国BD公司。其他试剂为市售分析纯试剂。

千分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司，JA1003N型)；4 ℃离心机(上海沪粤明科学仪器有限公司，TGL-16G)；酶标仪(深圳Rayto公司，RT-6000)；凝胶成像仪(北京原平皓生物技术有限公司，Tanon 4600)；Gene Quant紫外分光光度计(Pharmacia Biotech公司)；基因扩增仪GeneAmp PCR System 9700 (美国ABI公司，Applied Biosystems)；实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪Mx3000P(美国安捷伦科技公司)；流式细胞仪FC500(美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.2 细胞培养及分组 大鼠H9c2心肌细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中置于37 ℃孵育箱培养。长至80%～90%时去血清，加入无血清的DMEM培养基，将细胞分为正常对照组、AngⅡ模型组、AngⅡ+黄芪注射液组。正常对照组：正常孵育；AngⅡ模型组：10-7mol/L AngⅡ孵育；AngⅡ+黄芪注射液组：AngⅡ孵育浓度为10-7mol/L，同时加入0.125%黄芪注射液共同孵育。AngⅡ浓度参考文献[4-5]的剂量。不同处理组细胞孵育置于37 ℃孵育箱培养48 h后进行指标检测。

1.3 检测方法

1.3.1 CCK-8法检测细胞增殖 H9c2心肌细胞在96孔板中经不同浓度AngⅡ或黄芪注射液孵育48 h后，每孔100 μL培养基中加入CCK-8母液10 μL，孵育4 h，在450 nm波长处酶标仪测定其光吸收(OD)值。其OD值可以反映其活细胞数量及细胞活性。与实验孔平行设无细胞只加培养液的空白对照孔。实验结果以细胞存活率表示，细胞存活率=(实验组OD值-空白正常对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白正常对照组OD值)×100%。

1.3.2 RNA提取和RT-PCR 收集不同处理后细胞，提取总RNA。加入Trizol匀浆裂解。加氯仿室温震荡3 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清加异丙醇，冰上放置5 min后4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，弃上清加入75%乙醇洗液沉淀，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min弃上清，室温晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理H2O冰上溶解，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。取1 μg总RNA，在 oligo(dT)15和M-MuLV反转录酶作用下反转录为cDNA。Subgreen染料法进行荧光定量PCR检测基因表达。PCR反应体系为25 μL：5倍稀释的cDNA模板5 μL，5 μmol/L正向、反向引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，H2O 5.5 μL。反应条件为：94 ℃变性5 min，然后进行30次扩增反应：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，最后72 ℃延伸10 min。引物名称及序列详见表1。

表1 引物名称及序列(5′-3′)

1.3.3 蛋白提取和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测 收集不同处理的细胞于1.5 mL的EP管中，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗2遍。每管细胞(106个)加50 μL裂解液，超声波破碎仪裂解后置于冰上裂解10 min。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。收集上清液，BCA法测蛋白定量。配制十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶，蛋白上样。电泳至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时，结束电泳。将蛋白转膜至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭液室温敷育封闭1 h，加一抗GAPDH(1∶5 000)、VDAC1(1∶1 000)、Mfn2(1∶1 000)、GRP75(1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜。TBST缓冲液洗膜10 min，连续3次；二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜10 min，连续3次。增强型化学发光试剂(ECL)超敏发光液显色，使用Tanon4600凝胶成像仪进行图像扫描，Image J软件进行条带灰度值分析，以GAPDH为内参。

1.3.4 Fura-2法细胞钙含量检测 大鼠H9c2心肌细胞经不同分组培养48 h后，依据试剂盒说明操作。用D-Hanks洗涤细胞3次，每次1 min，加2.5 μmol/L Fura-2AM于37 ℃培养箱培养30 min。除去Fura-2AM工作液，用D-Hanks溶液洗涤3次，每次1 min，并放置37 ℃培养箱培养20 min，用酶标仪进行检测。分别检测340 nm、380 nm激发光下的510 nm发射光吸光度，计算两者比值即为细胞钙含量。

1.3.5 细胞凋亡检测 参照美国BD公司FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I说明书，将大鼠H9c2心肌细胞分组处理后收集细胞，PBS洗涤2次，在Binding buffer重悬细胞，浓度为106个细胞/mL。取100 μL，加5 μL异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)混匀后室温避光孵育15 min，加入Binding buffer 400 μL，流式细胞仪分析检测细胞凋亡情况。

2 结 果

2.1 不同浓度黄芪注射液对H9c2细胞活性的影响 进行体外H9c2心肌细胞培养，通过CCK-8方法检测不同浓度黄芪注射液对H9c2细胞增殖的影响。结果显示，黄芪注射液在浓度为0.125%时对H9c2细胞的促增殖作用最为显著。因此，后续实验选用0.125%浓度黄芪注射液进行细胞孵育。详见图1。

与对照组比较，＊P<0.05，#P<0.01。 图1 CCK-8法测定不同浓度黄芪注射液对H9c2细胞活性的影响(n=6)

2.2 3组H9c2细胞目的基因mRNA表达比较 大鼠H9c2心肌细胞在正常孵育，10-7mol/L AngⅡ及10-7mol/L AngⅡ+0.125%黄芪注射液处理48 h后，收集细胞提取总RNA，反转录后进行实时定量PCR检测。与正常对照组比较，AngⅡ模型组Mfn2、GRP75的mRNA表达明显增加(P<0.05)，AngⅡ+黄芪注射液组Mfn2、GRP75的mRNA表达低于AngⅡ模型组(P<0.05或P<0.01)，表明AngⅡ处理可以增加Mfn2、GRP75的mRNA表达，黄芪注射液可以抑制其表达的增高。3组VDAC1 mRNA表达比较差异无统计学意义。详见图2～图4。

与正常对照组比较，＊P<0.05；与AngⅡ模型组比较，# P<0.01。 图2 3组Mfn2 mRNA表达比较

与正常对照组比较，＊P<0.05；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01。 图3 3组GRP75 mRNA表达比较

图4 3组VDAC1 mRNA表达比较

2.3 3组H9c2细胞目的蛋白表达比较 H9c2心肌细胞在正常孵育，10-7mol/L Ang Ⅱ及10-7mol/L Ang Ⅱ+0.125%黄芪注射液处理48 h后，收集细胞提取总蛋白进行目的蛋白表达检测。与正常对照组比较，AngⅡ模型组VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达明显增加(P<0.05或P<0.01)，AngⅡ+黄芪注射液组VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达低于AngⅡ模型组(P<0.01)，表明AngⅡ孵育48 h可以导致MAM结构蛋白VDAC1、Mfn2和GRP75的表达增加，而黄芪注射液可以显著抑制AngⅡ诱导的VDAC1、Mfn2和GRP75蛋白表达的增加。详见图5～图8。

图5 Western Blot测定H9c2细胞中目的蛋白表达水平

与正常对照组比较，＊P<0.01；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01。 图6 3组VDAC1蛋白表达比较

与正常对照组比较，＊P<0.05；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01。 图7 3组Mfn2蛋白表达比较

与正常对照组比较，＊P<0.01；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01。 图8 3组GRP75蛋白表达比较

2.4 3组细胞钙含量比较 H9c2心肌细胞在正常孵育、10-7mol/L AngⅡ及10-7mol/L AngⅡ+0.125%黄芪注射液处理 48 h后，进行细胞钙含量检测。与正常对照组比较，AngⅡ模型组细胞钙含量明显增加(P<0.05)，AngⅡ+黄芪注射液组细胞钙含量低于AngⅡ模型组(P<0.01)，表明10-7mol/L AngⅡ处理48 h后可以导致细胞胞浆钙含量显著增加，黄芪注射液处理可以显著抑制这种增加，调节并维持细胞浆的正常钙含量。详见图9。

与正常对照组比较，＊P<0.05；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01。 图9 3组细胞钙含量比较(n=7)

2.5 细胞凋亡检测 H9c2心肌细胞在正常孵育、10-7mol/L AngⅡ及10-7mol/L AngⅡ+0.125%黄芪注射液分组处理48 h后，胰酶消化收集细胞进行流式细胞凋亡检测。与正常对照组比较，AngⅡ模型组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，AngⅡ+黄芪注射液组细胞凋亡率低于AngⅡ模型组(P<0.01)，表明AngⅡ处理细胞凋亡率较正常培养显著增加，黄芪注射液可以抑制由AngⅡ引起细胞凋亡率的增加。详见图10、图11。

图10 流式细胞仪检测3组细胞凋亡率

与正常对照组比较，＊P<0.01；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01。 图11 3组细胞凋亡率比较(n=4)(A为正常对照组；B为AngⅡ模型组；C为AngⅡ+黄芪注射液组)

3 讨 论

中医治疗慢性心力衰竭具有较好的临床疗效，具有多靶点、多途径的调节优势。临床研究发现，心气虚是慢性心力衰竭的基本病机之一，贯穿于慢性心力衰竭的始终，是疾病发生发展的重要因素。现代医学提示气与线粒体有关，气虚可以导致线粒体功能障碍[6]，改善线粒体功能是进一步提高治疗慢性心力衰竭的途径[7]。益气是治疗气虚证的基本原则，有研究表明益气药能够改善线粒体功能，进而改善心功能，最终改善心力衰竭心气虚症状[8]。

内质网为细胞内Ca2+储存的主要位点，MAM可以调节内质网与线粒体之间的Ca2+转移。生理状态下，线粒体中Ca2+增加可增强Krebs循环和电子传输链的活性，从而激活了线粒体基质中三磷酸腺苷(ATP)的合成[9]。线粒体Ca2+超载可引起线粒体内膜(IMM)中线粒体通透性过度孔(mPTP)的持续打开诱导细胞凋亡，同时mPTP的持续打开也可导致电子链的过度激活[10]，这与活性氧(ROS)形成的增加相关。此外，线粒体钙超载导致线粒体膜电位下降，基质pH升高，而这限制了线粒体产生强膜电位的能力，从而降低ATP的合成[11]。因此，MAM的异常形成在线粒体功能障碍中发挥重要作用。此外，MAM介导的Ca2+转运对血管和心肌细胞功能至关重要，因为其可通过调节细胞质内瞬时Ca2+浓度在调节动脉和心脏的收缩功能[12]，且在心肌肥厚及其向心力衰竭发展的过程中，可以观察到MAM的改变[13-14]。

维持MAM结构的蛋白及蛋白复合体有很多，主要包括Mfn2、1，4，5-三磷酸肌醇受体(inositol 1，4，5-triphosphate receptor，IP3R)、VDAC1以及GRP75。其中IP3R-VDAC1-GRP75蛋白复合体是内质网线粒体间Ca2+转运的重要通道，调控Ca2+从内质网到线粒体的转运。Mfn2在调节线粒体运动、定位、呼吸活动、线粒体吞噬，特别是在调节线粒体与内质网接触方面起着关键作用[15]。研究表明，Mfn2表达缺失则会破坏内质网形态，影响内质网与线粒体之间的相互作用，线粒体Ca2+摄取和氧消耗均受到损害，导致细胞死亡增加[16-17]。

临床实践表明，益气药能改善心力衰竭心气虚证的证候表现，但其具体作用机制尚未完全阐明。本研究以MAM结构作为研究对象，探讨益气药黄芪注射液通过调节MAM结构影响心肌细胞钙平衡以及细胞凋亡。结果显示，与正常培养的H9c2细胞比较，Ang Ⅱ处理后细胞Mfn2、GRP75的mRNA表达水平升高，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表达升高，细胞钙含量和细胞凋亡率升高，提示AngⅡ通过调节MAM结构调控细胞内钙稳态，最终影响心肌细胞凋亡。经黄芪注射液干预后，Mfn2、GRP75的mRNA表达降低，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表达降低，细胞钙含量和细胞凋亡率降低，提示黄芪注射液可能通过调控MAM结构蛋白的表达，影响MAM结构功能、细胞内钙调节，抑制细胞凋亡。

综上所述，黄芪可能通过调节MAM结构蛋白表达，影响MAM结构的功能、心肌细胞钙平衡和细胞凋亡，从而治疗心力衰竭。本研究从细胞内亚细胞器间的结构相互联系的角度阐释中医药治疗心力衰竭的物质基础，为今后心力衰竭的中医药临床治疗机制提供新的靶点和研究方向。