失笑散“异病同治”原发性痛经和慢性萎缩性胃炎的作用机制预测及动物试验验证

毛金花，耿楠，路遥，马子坤，张省委，韩冉

1 北京中医药大学第二临床医学院，北京100029；2 北京中医药大学东方医院

原发性痛经（PD）主要指骨盆内脏器没有出现器质性病变的痛经，其临床表现主要为行经前后及经期出现腹痛，并伴有恶心呕吐、头晕头痛、腰痛等症状，严重影响患者的生活质量［1-2］。中医属于“妇人腹痛”“经行头痛”等范畴。慢性萎缩性胃炎（CAG）是指胃黏膜上皮遭受反复损害导致固有腺体萎缩，伴或不伴有肠化生和异型增生的一种慢性胃部疾病［3］。临床表现常为胃痛痞满、嗳气泛酸、食欲减退等，中医学属“胃脘痛”“胃痞”等范畴。失笑散出自宋代陈师文等撰写的《太平惠民和剂局方》，其由五灵脂和蒲黄组成，有活血化瘀、散结定痛之功。此方配伍巧妙，目前临床应用于治疗多种疾病，如PD、子宫内膜异位症、CAG、冠心病等［4-6］，疗效显著。但目前失笑散治疗PD 和CAG 的作用机制仍不明确。2022年4—12月，本研究运用网络药理学预测失笑散治疗PD 和CAG 的作用机制，为中医“异病同治”提供理论依据；同时对失笑散治疗原发性痛经的机制进行动物体内实验验证。

1 材料与方法

1.1 数据来源、实验动物、试剂及仪器 药物靶点数据库：TCMSP、BATMAN-TCM；疾病靶点数据库：GeneCards、DrugBank、OMIM。SPF 级SD 雌性未孕大鼠60 只，5 周龄，体质量190～220 g［北京维通利华生物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0006］。动物在北京中医药大学附属东方医院实验中心饲养、开展实验，温度19～21 ℃，湿度50%左右。本实验经北京中医药大学东方医院实验动物伦理委员会批准（DF2022-19-04）。试剂：失笑散（炒蒲黄、五灵脂各15 g；各组方加水煎煮2 次，第1 次1.5 h，第2 次0.5 h，2 次药液混合后浓缩成1 g/mL的生药煎剂；上述中药均经北京中医药大学东方医院鉴定，符合国家药品标准规定）；布洛芬片（2019020303，0.1 g/片，河北恒利集团制药股份有限公司） ；苯甲酸雌二醇注射液（批号：120207，宁波市三生药业有限公司）；缩宫素注射液（批号：120302，上海禾丰制药厂）；戊巴比妥钠（批号：T20080530，金木水火土科技有限公司）。大鼠TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 试剂盒（碧云天生物技术有限公司），大鼠VEGFA、PTGS2 ELISA 试剂盒（英国ABCAM 公司）。仪器：AXTGL16M 离心机（恒诺仪器）、ELX800 型酶标仪（美国Bio Tex 公司）、电子天平、移液枪。

1.2 失笑散治疗PD、CAG作用机制的预测方法

1.2.1 失笑散的活性成分及作用靶点筛选 通过TCMSP 数据库获取失笑散中“蒲黄”的活性成分，规定口服生物利用度（OB）≥30% 及类药性（DL）≥0.18［7-8］，获取对应中药的活性成分及对应靶点；通过BATMAN-TCM 数据库获取失笑散中“五灵脂”的活性成分，规定Score cutoff≥30 及P≤0.05。UniProt数据库规范靶点蛋白的基因名，获取失笑散的活性成分和作用靶点。

1.2.2 失笑散作用靶点与PD、CAG 疾病靶点的交集靶点获取 以“primary dysmenorrhea”“chronic atrophic gastritis”为关键词在GeneCards、DrugBank及OMIM数据库中分别进行检索，得到PD与CAG疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集。

1.2.3 失笑散治疗PD 和CAG 的核心活性成分、核心靶点获取 利用Cytoscaape3.9.1 软件构建交集靶点—活性成分—药物—疾病网络图。利用Network Analyzer 来计算网络图中关键节点度值（Degree）及介数中心性（BC）。依据节点度值，由大到小筛选出度值排名前五的核心活性成分。利用STRING 数据库，输入上述交集靶点，物种限定为人，选择置信度分值＞0.40，构建蛋白互作网络（PPI）图。利用Cytoscape 软件对PPI 结果进行可视化处理。依据节点度值，由大到小筛选出度值排名前五的核心靶点。

1.2.4 核心靶点的生物信息学分析 通过DAVID数据库对核心靶点进行GO 功能富集与KEGG 功能富集分析，P＜0.05 为筛选条件，预测失笑散治疗PD、CAG 的作用机制。按P值由小到大排序，选择前10条GO各分类功能富集结果和前20条KEGG通路。

1.2.5 失笑散核心活性成分与核心靶点分子对接 将度值排名前5 的核心靶点和核心药物活性成分经过AutoDockTools-1.5.6 软件进行分子对接，统计各个组合的打分。结合能＜-5.0 kcal/mol 表示两者之间结合活性较好；＜-7.0 kcal/mol表示两者之间结合活性强烈［9-10］。利用PyMOL 软件将对接结果可视化，同时绘制出“蛋白—分子”对接作用模式图。

1.3 失笑散治疗PD、CAG 作用机制的动物实验验证方法

1.3.1 大鼠分组、PD 模型建立与失笑散灌胃给药 大鼠以普通固体饲料、自来水适应性喂养5 d后，随机分为失笑散低、中、高剂量组（2.5 g/kg，5 g/kg，10 g/kg）［11］，模型组，阳性对照组（布洛芬20 mg/kg）［12］及阴性对照组，每组各10 只。除外阴性对照组，其余各组均参考相关文献［13］建立PD 动物模型，大鼠均股部皮下注射苯甲酸雌二醇10 d，每天1 次，第1、10 天皮下注射1.2 mL/kg，第2 至9 天皮下注射0.5 mL/kg；阴性对照组皮下注射等量生理盐水。造模过程中从第4 天各给药组开始注射苯甲酸雌二醇后立即灌胃对应治疗药品，对照组大鼠灌胃等量生理盐水，每天1 次。第11 天阴性对照组皮下注射生理盐水1.0 mL/ kg，剩余各组大鼠腹腔注射缩宫素1.0 mL/kg。第12 天大鼠麻醉处死，取血液开展下一步实验。若模型大鼠出现腹部内凹、躯干和后肢伸展等明显扭体反应，说明造模成功［14］。

1.3.2 大鼠扭体反应次数、子宫收缩抑制率和子宫指数的测算 大鼠扭体反应的次数：在给药前和末次给药后1 h，按照10 mL/kg为大鼠腹腔注射0.6%醋酸，记录大鼠20 min 内出现扭体反应的次数。子宫收缩抑制率和子宫指数：检测扭体反应后，用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，在下腹部的正中作5 cm 切口，将子宫取出，选左侧子宫角长3 cm 的一段，然后将子宫角阴道端和卵巢端分别缝在塑料丫形支架上底的两端，将子宫两指点中间用一条棉线固定，棉线从塑料管引出连接到传感器，各组大鼠尾静脉注射0.025 U缩宫素，5 min后各组大鼠灌胃相应药物，记录在给药后60 min 子宫平滑肌的活动，最后称取子宫质量，计算子宫收缩抑制率和子宫指数。子宫收缩抑制率（%）=（给予缩宫素后数值-给予缩宫素前数值）/给予缩宫素前数值×100%；子宫指数（%）=子宫湿质量/体质量×100%。

1.3.3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1 与子宫组织VEGFA、PTGS2 的检测 采用ELISA 法。大鼠麻醉处死，取颈动脉血4 mL 及子宫组织，将子宫组织放置于-80 ℃冰箱冻存。将血液置于不加抗凝剂的离心管中，3 000 r/min离心10 min，将血清按照试剂盒说明书操作，测出各组血清TNF-α、IL-6、IL-1。各组取0.1 g 子宫组织进行称重，掺入0.9 mL 生理盐水，用组织匀浆器来匀浆，12 000 r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒上说明书进行操作，得到子宫组织中VEGFA和PTGS2的水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。数据采用Shapiro-Wick 方法行正态性检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的数据比较采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 失笑散治疗PD、CAG 作用机制的预测结果 ①失笑散活性成分、失笑散与疾病的交集靶点：失笑散活性成分15 个，其中蒲黄8 个，分别为黄杞苷、花生四烯酸、异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、棕榈酸睾酮、山奈酚-3-O-β-D-槐糖苷、槲皮素；五灵脂7个，分别为波那拉酮A、尿酸、五灵脂酸、4'-联苯酚、续断皂苷E1、尿素、三羟基异胆固醇酸。将失笑散2味中药的靶点合并，保留惟一值，共218个靶点。在GeneCards、DrugBank 及OMIM 3个数据库中获得PD与CAG 相关靶点分别为712个、821个。将PD、CAG相关靶点与失笑散作用靶点取交集，得到35个交集靶点。②失笑散治疗PD 和CAG 的核心有效成分、核心靶点：交集靶点—活性成分—药物—疾病网络图见图1。其中包含53 个节点和167 条边组成，分别为药物节点1 个（V 形），成分节点15 个（圆角矩形），靶点基因节点35 个（椭圆形）及2 个疾病节点（菱形）。quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、arachidonic acid（花生四烯酸）、isorhamnetin（异鼠李素）等可能是失笑散治疗PD 和CAG 的核心有效成分。PPI 图见图2。IL-6、TNF、TP53、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（VEGFA）、白介素1β（IL-1β）等是失笑散治疗PD及CAG 的潜在核心靶点。③生物学功能：GO 分析结果共有442 个项目（BP：374，CC：21，MF，47），生物过程富集于基因表达的正、负向调节、RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、药物反应等；细胞组成方面主要是在细胞溶质、细胞核、细胞外空隙等；在分子功能上着重于酶结合、转录因子结合、蛋白激酶绑定等。KEGG 分析共获得121 条通路，与内分泌、代谢、癌症等相关。④分子对接结果：对接后统计打分可知核心靶点和药物核心有效成分平均结合能为-7.02 kcal/mol，分子对接的具体信息见表1。

表1 失笑散核心活性成分与核心靶点分子对接信息

图1 失笑散治疗PD与CAG的交集靶点—活性成分—药物—疾病网络图

图2 交集靶点的PPI图

2.2 失笑散治疗PD、CAG 作用机制的验证结果①各组大鼠的扭体反应次数、子宫收缩抑制率及子宫指数：与对照组比较，模型组大鼠扭体次数增多、子宫指数升高，子宫收缩抑制率降低；与模型组比较，失笑散低中高剂量组扭体次数降低、子宫指数降低，子宫收缩抑制率升高（P均＜0.05），详见表2。②各组血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平及子宫组织PTGS2、VEGFA 水平比较：与对照组比较，模型组IL-1、IL-6及TNF-α 的水平上调（P均＜0.05）；与模型组比较，失笑散中高剂量组IL-1、IL-6 及TNF-α 水平均降低（P均＜0.05）；与对照组比较，模型组PD 大鼠子宫组织中PTGS2和VEGFA的水平升高（P均＜0.05），与模型组比较，失笑散中高剂量组PTGS2和VEGFA的水平降低（P均＜0.05），详见表3。

表2 各组大鼠扭体反应、子宫收缩抑制率及子宫指数比较（±s）

表2 各组大鼠扭体反应、子宫收缩抑制率及子宫指数比较（±s）

组别n 子宫收缩抑制率（%）子宫指数（%）失笑散低剂量组失笑散中剂量组失笑散高剂量组模型组阳性对照组阴性对照组52.36 ± 5.52 39.77 ± 4.46 37.02 ± 3.85 66.64 ± 5.78 28.34 ± 3.41 25.63 ± 3.71 10 10 10 10 10 10扭体反应（次）给药前33.53 ± 5.41 36.21 ± 5.94 37.71 ± 6.17 37.42 ± 5.32 38.27 ± 5.28 1.21 ± 0.63给药后13.42 ± 1.63 11.76 ± 1.45 9.25 ± 0.64 31.26 ± 3.48 5.32 ± 0.73 1.29 ± 0.52 62.73 ± 10.33 75.45 ± 8.44 93.74 ± 7.53 0.17 ± 0.18 96.08 ± 6.83 96.87 ± 9.75

表3 各组血清中TNF-α、IL-6、IL-1水平及子宫组织中PTGS2、VEGFAS水平（±s）

表3 各组血清中TNF-α、IL-6、IL-1水平及子宫组织中PTGS2、VEGFAS水平（±s）

组别失笑散低剂量组失笑散中剂量组失笑散高剂量组模型组阳性对照组阴性对照组n 10 10 10 10 10 10 IL-1 （pg/mL）84.89 ± 29.66 65.43 ± 20.57 58.65 ± 18.97 103.44 ± 30.65 60.42 ± 20.27 42.02 ± 11.21 IL-6 （pg/mL）98.38 ± 20.22 80.81 ± 16.32 72.54 ± 17.88 114.36 ± 23.83 71.89 ± 18.54 58.21 ± 11.58 TNF-α（pg/mL）138.51 ± 30.38 97.33 ± 20.24 92.81 ± 19.81 166.56 ± 37.84 91.23 ± 21.31 88.33 ± 22.45 PTGS2（ng/L）422.21 ± 20.18 356.43 ± 20.07 363.22 ± 20.11 447.45 ± 34.73 362.75 ± 19.76 356.93 ± 16.88 VEGFA（ng/L）77.15 ± 8.24 68.76 ± 7.97 59.16 ± 8.72 80.21 ± 10.35 55.88 ± 8.19 58.02 ± 7.97

3 讨论

失笑散中五灵脂、蒲黄等量配伍，酽醋煎煮，增其活血化瘀止痛之功。原方常用于治疗妇科PD、产后腹痛、子宫内膜异位症等血瘀之证，现代也被广泛应用于治疗CAG、冠心病等多种疾病，体现了中医的异病同治。PD 及CAG 西医病因虽不相同，但中医病机两者都有“瘀”。

本研究运用TCMSP 数据库筛选出失笑散活性成分15 个，其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等可能是失笑散治疗PD 及CAG 的核心成分。槲皮素通过抑制环氧合酶与脂氧合酶，进而减少致炎物质的生成，从而缓解PD 的疼痛［15-16］；槲皮素可通过调节NLRP3 炎症小体和抑制环氧化酶-2（COX-2）的表达起到抗炎作用，抑制胃癌细胞的增殖和侵袭［17-18］。山奈酚主要通过调节促炎性因子的活性和炎症相关的基因表达，抑制转录因子、黏附分子等来发挥抗炎作用［19-20］。β-谷甾醇具有抗炎、免疫调节、抗氧化及抗肿瘤等作用［21］。CHOI 等［22］通过研究发现，β-谷甾醇可抑制IL-6 的活性、减少炎性因子（TNF-α、IL-1β 等）的分泌及一氧化氮（NO）的产生来发挥抗炎作用。因此，推测失笑散的核心活性成分可能是通过抗炎机制来发挥治疗PD 及CAG的作用。

PPI 分析发现，IL-6、TNF、TP53、VEGFA、IL-1β等是失笑散治疗PD及CAG 的潜在核心靶点。IL-6、TNF 是常见的炎症细胞因子，两者水平过高可能会导致慢性炎症疾病［23］。IL-6与相应受体结合后可促使细胞分化并产生较多免疫球蛋白，引起炎症发生发展［24］。TNF 可刺激细胞增殖分化，同时抑制细胞的凋亡，促使炎症及肿瘤的发展，加重CAG［25］。IL-1β 是一种促炎性细胞因子，炎性信号激活炎症小体来刺激IL-1β 的分泌，IL-1β 的过量分泌会引起炎症反应，出现炎性损伤［26］；同时IL-1β 还是一种胃酸分泌抑制剂，持续的低酸环境会促进萎缩的发展，提高胃癌的发生风险［27］。综上所述，这些关键靶点基因都在炎症反应中发挥重要作用，是失笑散治疗PD和CAG患者的核心靶点。

KEGG 分析表明，失笑散治疗PD及CAG 主要表现在癌症信号通路、AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路等。IL-17 信号通路是一种经典炎症信号通路，此通路上的IL-17 与特异性受体IL17RA、IL17RC结合，通过胞内信号传导分子ACT1和TRAF6 来激活NF-κB，开启下游炎症反应［28-29］。TNF 信号通路与炎症反应密切相关，其与肿瘤坏死因子受体1 （TNFR1） 结合后被激活，激活的TNF 信号通路可促进促炎因子、趋化因子和TNF-α 等基因的表达［30］。TNF可激活胃黏膜中分布的各种炎性细胞，刺激炎性细胞来释放炎性因子，进而加重胃黏膜的炎症程度，引起腺体坏死，使固有腺体减少和萎缩［31］。失笑散可能通过作用于以上炎症相关通路来抑制炎症因子的释放，从而达到治疗PD 和CAG 的效果。

分子对接结果预测到药物活性成分β-谷甾醇与TNF、TP53、VEGFA、IL-1β 结合良好，槲皮素与TNF、异鼠李素与TNF 结合良好，表明失笑散可能通过以上相关活性成分和核心靶点发挥治疗PD 的效果，为进一步开展动物实验验证打下基础。

本研究后续开展了PD大鼠体内的实验，对失笑散治疗PD 的镇痛、抗炎机制进行药效学方面的验证，结果表明其可显著降低子宫指数、扭体次数，升高子宫收缩抑制率；对血清中TNF-α、IL-6 及IL-1的表达出现明显抑制作用；对VEGFA、PTGS2 的表达水平也有显著抑制作用。此实验证实了失笑散可能通过抑制炎症因子的释放，通过抗炎镇痛来治疗PD。

综上所述，失笑散可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分与TNF、IL-6、TP53、VEGFA、IL-1β等主要靶点蛋白结合，抑制IL-17、TNF等炎症信号通路治疗PD及CAG，失笑散的用药剂量以5 g/kg、10 g/kg为佳。