PDZK1基因启动子区rs12129861位点基因多态性与新疆汉族男性人群痛风发病的关系

何爽，夏依代·图尔荪，孙红光，刘璐，叶飞，王宇婷，李瑞，苗蕾

1 新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐830000；2 新疆医科大学附属第一医院；3 新疆生产建设兵团疾控中心；4 新疆医科大学基础医学院

痛风是一种炎症性关节炎，由于血清尿酸（SUA）水平过高，导致关节内尿酸钠结晶沉积从而引发的炎症性疾病［1］。近年痛风患病率正在逐渐升高［2］，有资料显示，中国部分地区的痛风患病率已达2.6%［3］。在所有国家中男性的痛风患病率明显高于女性，是女性的2～6 倍［4］。痛风受到众多因素的影响，除了已知的环境因素如高嘌呤饮食、饮酒和吸烟外，遗传因素也参与痛风的发生，识别遗传因素对于提高痛风的病因诊断和治疗是必要的［5］。全基因组关联分析（GWAS）研究［6］表明，普通人群的痛风发展与常见的基因突变有关。单核苷酸多态性（SNP）是人类可遗传变异中最为常见的一种，在所有已知的可遗传变异中占比高达90%，在多因素疾病研究中具有重要意义。大量的研究发现了与痛风疾病发病存在相关的许多SNP［7］。

PDZ 蛋白激酶1（PDZK1）是一种已在肾脏、肝脏、小肠和肾上腺皮质中发现的细胞骨架蛋白，其并不直接参与血尿酸的转运，而是与许多尿酸转运蛋白相互作用以控制尿酸转运［8-9］。人PDZK1 基因位于lq21，存在多个SNP 位点，某些功能性位点的变异可以影响PDZK1 蛋白的表达。rs12129861 位点位于PDZK1 基因上游约2 kb，可能会影响PDZK1的基因表达水平，不同个体rs12129861 基因型的不同可能导致尿酸盐转运体转运效率的不同［10］。GWAS 显示，，尿酸浓度的个体差异可能使得PDZK1 基因产生变异，从而导致个体间痛风发病率的不同［10］。以上提示PDZK1 基因启动子区rs12129861 位点可能与痛风发病相关，可能通过影响尿酸转运体的功能导致尿酸转运效率的差异。新疆乌鲁木齐市汉族男性痛风是否与PDZK1 基因启动子区rs12129861 位点的SNP 有关目前仍未见报道，本研究以新疆乌鲁木齐市301 例汉族男性痛风患者与514 例汉族男性体检健康人群作为研究对象，对PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点等位基因和基因型分布频率进行分析，并比较了所有研究对象中不同基因型人群的尿酸浓度，以明确rs12129861（A/G）位点SNP 多态性是否与痛风发生存在关联，并采用双荧光素酶报告基因实验证实启动子区rs12129861（A/G）位点是否影响荧光素酶基因的表达。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018—2020年在新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院、新疆维吾尔自治区中医医院就诊的汉族男性痛风患者301 例（痛风组），年龄（47.64 ± 12.48）岁，入选者符合国际风湿病学会（ACR）2015年制定的痛风分类标准；同时选择同时期在上述三家医院体检的男性体检健康者514 例（对照组），年龄（46.15 ± 13.15）岁，两组间年龄差异无统计学意义（P＜0.05）。痛风组尿酸（512.85 ± 134.00）μ mol/L、葡萄糖（5.82 ± 1.86）mmol/L、尿素氮（5.72 ±3.68）mmol/L、肌酐（96.22 ± 54.28）μmol/L、甘油三酯（1.99 ± 1.53）mmol/L、总胆固醇（4.57 ±1.11）mmol/L，收缩压（125.56 ± 13.34）mmHg、舒张压（81.11 ± 11.12）mmHg。对照组尿酸（344.70 ±55.05）μmol/L、葡萄糖（5.34 ± 1.19）mmol/L、尿素氮（5.83 ± 15.27）mmol/L、肌 酐（85.90 ±13.00）μmol/L、甘油三酯（1.71 ± 1.17）mmol/L、总胆固醇（4.65 ± 0.89）mmol/L，收缩压（124.66 ±13.31）mmHg、舒张压（76.25 ± 9.51）mmHg。痛风组尿酸、葡萄糖、肌酐、甘油三酯以及舒张压值高于对照组（P均＜0.05），两组尿素氮、总胆固醇以及收缩压相比较，P均＞0.05。本次研究经新疆医科大学公共卫生学院伦理委员会批准，所有受试者在纳入研究前均给予知情同意。

1.2 PDZK1 基因启动子区rs12129861 位点基因型分析 采用多重荧光PCR 法。研究对象禁食12 h后于清晨采集空腹静脉血2 mL，EDTA 抗凝，采用全血基因组DNA 提取试剂盒（北疆百泰克公司）提取DNA，使用紫外分光光度仪进行定量，琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，质检合格的样本稀释至50 ng/μL，放于-80 ℃冰箱保存。在NCBI 数据库中查询到rs12129861（A/G）位点的序列信息，利用Primer 6.0 软件设计引物，由上海天昊公司合成。上游引物序列：5′-GCTGTTGTTGTTGTTGTTG-3′，下游引物序列：5′-GGCAGGAGAATCACTTGAA-3′。PCR 反应条件：在20 g/L 琼脂凝胶电泳中，95 ℃2min→94 ℃ 20 s→65 ℃ 40 s→72 ℃ 1.5 min，共11个循环，94 ℃ 20 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 1.5 min，24 个循环，72 ℃ 2 min。扩增结束后，由上海天昊公司采用SNP 分型技术对所有样本进行rs12129861（A/G）位点基因多态性及基因的分型分析。

1.3 PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点活性的检测 采用双荧光素酶报告基因实验。查阅NCBI 数据库，得到rs12129861 位点的序列具体信息，采用基因合成法合成基因，然后以合成基因为模板进行基因扩增得到长度大约为1 013 bp 的DNA片段。基因扩增反应条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、2 min，72 ℃、1 min，25个循环。基因扩增后的产物和pGL3-promotor 质粒用T4DNA 连接酶（TaKa-Ra 公司）置于16 ℃连接0.5～1 h，获得pGL3-rs12129861（A/G）-promotor 重组质粒。将重组质粒加入装有TOP10 感受态细胞的离心管中，在管中加入SOC 液体培养基使细胞复苏、表达PDZK1 基因rs12129861 位点，然后接种到LB 培养基（含Ap 抗生素）上。培养12～16 h 后筛选菌落进行基因扩增验证，对目的基因序列进行基因测序，结果证明重组质粒构建成功。将胰酶消化过的HEK293T 细胞用10% DMEM 完全培养基按照每孔0.5×105～2×105个细胞的密度接种在24 孔细胞板上，于含5% CO2的37 ℃温箱中孵育8～24 h，细胞完全贴壁后可开始瞬时转染。将1 μg 的rs12129861 位点质粒和200 ng内参照pRL-TK（海肾荧光素酶报告载体）以及2.4 μL TurboFect 混合，加入到200 μL Opti-Medium内，室温孵育15 min。按照TurboFect 试剂盒（Ther-mo 公司）说明书，配制TurboFect-DNA Mix，将其加入到上述含有单层HEK293T 细胞的培养基中，轻摇混匀，继续孵育。37 ℃孵育8～12 h 后，换成含有血清且已经经过37 ℃预热的培养基。共转48 h 后，收集细胞，进行荧光素酶活性检测。每个孔用磷酸盐缓冲液漂洗细胞1 次后，加入100 μL 裂解液裂解15 min。每个酶标板孔内20 μL 裂解液以及100 μL荧光素酶检测试剂Ⅱ（PROMEGA 公司），用酶标仪记录测定值；加入荧光素酶湮灭剂100 μL，记录测定值。以海肾荧光素酶（Ranilla luciferase）作内参照，消除实验操作带来的变化因素，增加可比性。两次数值的比值为荧光素酶相对活性，重复实验3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验；计数资料用频次或百分比表示，组间比较采用χ2检验；利用Hardy-Weinberg 平衡性检验确认此次所采样本的群体代表性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点的基因型和基因频率与新疆地区汉族男性人群痛风发病的关系

2.1.1 痛风组与对照组PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点的基因型和基因频率比较PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡性检验，该位点在新疆地区汉族人群中达到稳定遗传状态，具有代表性（χ2=0.427，P＞0.05）。痛风组 PDZK1 基因rs12129861（A/G）位点AA、GA、GG 基因型分别有6例（1.99%）、80 例（26.58%）、215 例（71.43%）。对照组PDZK1 基因 rs12129861（A/G）位点AA、GA、GG 基因型分别有24 例（4.67%）、189 例（36.77%）、301 例（58.56%）。两组间AA、GA、GG 基因型分布频率的差异有统计学意义（χ2=14.633，P＜0.01）。痛风组等位基因A 频次为 92（27.96%），等位基因G 频次为237（72.04%）；对照组等位基因A 频次为510（41.50%），等位基因G 频次为719（58.50%）。PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点等位基因A 和G 在两组间的分布频率差异具有统计学意义，痛风组等位基因G 频次高于对照组（χ2=14.236，P＜0.01）。携带G 等位基因的个体患痛风的OR值为1.661（95%CI：1.274～2.165），携带A 等位基因的个体患痛风的OR值为0.602（95%CI：0.462～0.785）。

2.1.2 PDZK1 基因 rs12129861（A/G）位点不同基因型分组的一般性临床指标比较 血清尿酸浓度在不同基因型分组间的差异具有统计学意义（P=0.011），经两两比较后发现，A/A 组与G/G 组间、G/A组与G/G组间血清尿酸浓度的差异具有统计学意义（P均＜0.05），其中G/G组血尿酸浓度大于其余两组。葡萄糖、尿素氮、肌酐、甘油三酯、总胆固醇、收缩压、舒张压在各组间的差异无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

基因型A/A G/A G/G尿酸（μmol/L）369.11 ± 89.58 392.94 ± 125.23 415.763 ± 122.33葡萄糖（mmol/L）5.50 ± 1.65 5.46 ± 1.28 5.56 ± 1.61尿素氮（mmol/L）5.22 ± 1.79 6.50 ± 21.14 5.42 ± 2.79肌酐（μmol/L）89.02 ± 37.07 88.32 ± 18.05 90.21 ± 40.70甘油三酯（mmol/L）2.00 ± 1.50 1.78 ± 1.16 1.79 ± 1.27总胆固醇（mmol/L）4.77 ± 0.84 4.67 ± 0.96 4.58 ± 0.99收缩压（mmHg）125.93 ± 16.75 125.36 ± 12.78 124.57 ± 13.11舒张压（mmHg）77.07 ± 10.11 77.94 ± 9.28 77.86 ± 10.68

2.2 PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点的基因型和基因频率与新疆地区汉族男性人群痛风发病关系的验证 pGL3-rs12129861（G）-promotor重组质粒荧光素酶相对活性为5.046，pGL3-rs12129861（A）-promotor 重组质粒荧光素酶相对活性为9.160。与pGL3-promotor 空载质粒比较，目的序列rs12129861 含G、A 等位基因的重组质粒荧光素酶相对活性分别是pGL3-promotor 的5.001 倍（P＜0.01）和9.078 倍（P＜0.01），pGL3-rs12129861（A）-promotor 重组质粒荧光素酶相对活性是pGL3-rs12129861（G）-promotor 重组质粒荧光素酶相对活性的1.815倍（P＜0.01）。

3 讨论

目前痛风的病因涉及多种因素，包括细胞因子、易感基因和基因突变，但其确切的发病机制尚未阐明。痛风遗传模式十分复杂，尽管在对发病机制和治疗进展的理解上取得了重大进展，但痛风的发病率仍在增加，许多患者的疾病控制不佳［11］。环境和遗传因素均可影响痛风的发生和发展。GWAS 表明，常见的基因突变使一般人群更易患痛风［12］。基因表达调控可以在不同水平、多个阶段进行，曾有一项GWAS 研究系统地评估与疾病病因有关的常见（＞1%患病率）遗传变异的基因组［13］，这些变异基因的作用通常较弱，大多数通过调节基因表达、转录稳定性和转录处理发挥作用，但调控基因表达最有效的方法是在转录水平进行。多项流行病学研究显示，遗传因素在原发性痛风中具有重要作用，并且已经发现20 多个遗传易感位点［14］，PDZK1 就是其中之一。有GWAS显示PDZK1 基因rs12129861 位点与尿酸水平相关。rs12129861 位于PDZK1 基因上游约2 kb 处属于基因启动子区，可能影响PDZK1 的基因表达水平。基因启动子区是参与特定基因转录及其调控的DNA 序列［14］，包含第一外显子上游的核心启动子区、较远端的调节启动子区、远端调控序列（增强子与抑制子）及基因间的边界元件或隔离成分（隔离子），是调控靶基因转录的重要区域，但并不编码蛋白。变异的基因启动子区可能会通过影响靶基因蛋白的表达，从而改变了靶基因在人体中显示出的生物学功能，我们前期已经通过查阅NCBI 数据库筛选出候选基因并利用SNP 分型实验对可能影响候选基因表达的SNP 位点进行了检测，本研究中需要进行验证的阳性位点就出自我们已经筛选建立出的SNP 位点数据库。

痛风是一种由尿酸水平升高引起的常见关节炎疾病，尿酸水平升高是痛风的一个重要独立危险因素。PDZK1 基因已被确定与尿酸浓度有关，PDZK1作为支架蛋白并不直接参与血尿酸转运，而是通过调控多个转运蛋白对尿酸排泄产生影响，因此如果影响了PDZK1 蛋白的表达那么很可能会影响尿酸浓度从而影响痛风的发生。目前已知PDZK1 能够与尿酸盐阴离子转运蛋白1（URAT1）和肾脏尿酸分泌转运蛋白钠离子依赖磷酸盐转运体1（NPT1）相互作用影响血尿酸水平。URAT1 由SLC22A 家族中的SLC22A12 基因编码，被认为是介导肾脏近端小管顶端侧尿酸盐重吸收的重要分子［15］。SLC17A1编码的NPT1 通过钠离子的协同作用将尿酸从肾小管上皮细胞顶面转运至细胞外，是负责尿酸排泄的转运蛋白之一。

本研究PDZK1基因启动子区rs12129861（A/G）位点基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡性检验，说明该位点在新疆地区汉族人群中达到稳定遗传状态，具有代表性。本研究还发现PDZK1 基因启动子区rs12129861的基因型分布频率和等位基因分布频率在痛风组和对照组之间的差异具有统计学意义，其中G等位基因在痛风组分布的频率为72.04%，在对照组的分布频率为58.5%，差异具有统计学意义，携带G 等位基因的个体患痛风的OR值为1.661。在不同基因型分组下，G/G 基因型组尿酸的浓度最高，与其他组相比差异具有统计学意义。以上结果表明PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点SNP 可能与新疆地区汉族男性人群的痛风有一定的关系，G 等位基因可能是痛风发病的危险因素。在此基础上利用双荧光素酶报告实验的方法，检测PDZK1 基因启动子区rs12129861 位点对荧光素酶基因表达活性的影响。结果显示与空载质粒（含Sv40 启动子）相比，rs12129861（A/G）位点具有增强子功能，能检测到荧光强度（P＜0.05）。此外，rs12129861 位点含等位基因G 重组质粒的荧光素酶报告基因的表达水平与含等位基因A 重组质粒相比显著降低。因此含有G 等位基因的rs12129861 位点的增强子活性较低，这有可能导致PDZK1 蛋白表达减少，从而降低尿酸转运率使得患痛风的风险增加，这与基因频率分布比较的结果相一致。

综上，PDZK1 基因启动子区rs12129861 位点的SNP 可能与新疆地区汉族男性人群痛风发病有关，且带有等位基因G 的个体痛风患病风险更高。但本次研究仍有许多不足之处，由于rs12129861位点属于PDZK1 基因启动子区并不能编码蛋白只能调控基因转录，因此并不一定能影响PDZK1 蛋白最终的表达，我们尚未发现痛风组患者与对照组人群的PDZK1 蛋白浓度之间的差异。有研究显示可溶性尿酸升高可以增加PDZK1 的表达［16］，当痛风患者体内血清尿酸浓度增加，为了转运多余的尿酸，转运蛋白URAT1 和NPT1 表达增加，作为有调控作用的支架蛋白PDZK1 蛋白的浓度反而可能升高，这为我们此后的研究提供了新的方向和思路。