定心方抑制PI3K/Akt 通路减轻脂质运载蛋白-2 诱导巨噬细胞炎症反应的机制研究

★ 万强 胥玉林 丁桃 郑翠翠 涂梦婷 赵瞳 鲁启文（.江西中医药大学附属医院 南昌 330006；.江西中医药大学 南昌 330004）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种由氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）沉积于血管内壁而引起机体发生的一种慢性炎症性疾病，可严重危害人类健康［1］。巨噬细胞是破裂AS 斑块的主要细胞组成部分，其炎症反应可促进AS 的形成［2］。脂质运载蛋白-2（lipocalin-2，LCN2）是由脂肪细胞分泌的与炎症密切相关的新型脂肪细胞因子，其高表达可通过诱导炎症反应促进AS 的发生［3］。定心方（dingxin recipe，DXR）是由丹参、赤芍、苦参等10 余味药物组成的中医心血管疾病经验方，既往研究证实DXR 对AS 疗效确切，但DXR 能否通过减轻LCN2诱导巨噬细胞炎症反应从而发挥抗AS 效应，目前尚不明确。本研究采用RAW264.7 巨噬细胞为研究对象，并通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制剂LY294002 及蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抑 制 剂Triciribine，观 察DXR 含药血清对LCN2 诱导巨噬细胞炎症反应的干预作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 DXR 组成：苦参20 g，黄连18 g，党参18 g，酸枣仁20 g，茯苓15 g，丹参15 g，葛根15 g，瓜蒌12 g，三七12 g，赤芍12 g，红花10 g，灵芝10 g。以上药材购于江西中医药大学附属医院中药房，并经江西中医药大学中药品种鉴定确认。

1.1.2 细胞株 RAW264.7 巨噬细胞（南昌鼎国生物有限公司，批号C1046）。

1.1.3 试剂 DMEM 培养基（武汉普诺赛公司，批号2106）；胎牛血清（杭州四季青公司，批号12147）；重组LCN2 细 胞 因子（美国ProSpec 公司，批号ENZ-297）；PI3K 及Akt 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司，批号分别为2922、3896）；LY294002 及Triciribine（美国Sigma 公司，批号分别为34915、28732）；白细胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、超敏C 反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）试剂盒（美国eBioscience 公司，批号分别为80021086、80282079、80354308）。

1.1.4 仪器 细胞培养箱、离心机（美国Thermo公司）；透射电镜（日本电子公司）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；酶标仪（美国Bio-Tek 公司）。

1.2 方法

1.2.1 DXR 含药血清的制备 3 月龄SD 雄性大鼠灌胃DXR 药液18.60 g/（kg·d），连续灌胃7 d，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，4℃静置4 h，离心机中以3 000 r/min 离心10 min，取上清液即为血清，水浴灭活30 min 后滤膜抽滤除菌，DXR 含药血清置入4 ℃冰箱保存。

1.2.2 细胞分组及处理 RAW264.7 巨噬细胞加含10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于含5% CO2的细胞培养箱中培养。细胞分为6组：（1）空白对照组：加空白血清；（2）LCN2 组：以10 μmol/L 的LCN2作用RAW264.7 巨噬细胞48 h；（3）空白血清组：以空白血清预处理巨噬细胞1 h，再加10 μmol/L的LCN2 刺激48 h；（4）DXR 含药血清组：以5% DXR 含药血清预处理巨噬细胞1 h，再加10 μmol/L的LCN2 刺激48 h；（5）LY294002 组：以5% DXR含药血清预处理巨噬细胞1 h 后再以10 μmol/L 的Y294002 预处理巨噬细胞30 min，加10 μmol/L 的LCN2 刺 激48 h；（6）Triciribine 组：以5% DXR含药血清预处理巨噬细胞1 h 后再以20 μmol/L 的Triciribine 预处理巨噬细胞30 min，加10 μmol/L 的CN2 刺激48 h。

1.2.3 CCK-8 法检测巨噬细胞活力 RAW264.7巨噬细胞以1×105/ 孔种于96 孔培养板中，加100 μL 培养基，每组设5 个复孔，24 h 后弃上清液，加10 μL CCK-8 液，酶标仪检测各复孔450 nm 处吸光度（A）值。

1.2.4 ELISA 法检测巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平 收集各组细胞培养上清液，ELISA 法检测细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。

1.2.5 Western blot 检测巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表达 收集RAW264.7 巨噬细胞，离心后加入细胞裂解液，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、封闭。IL-6、TNF-α、hs-CRP 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶2 000）室温孵育2 h。ECL 显色、曝光、Image J 分析条带灰度值，β-actin 为内参蛋白。

1.2.6 透射电镜检测巨噬细胞自噬小体数量 收集RAW264.7 巨噬细胞，离心后锇酸缓冲液固定、环氧树脂包埋后制作成切片，染色后于透射电镜观察RAW264.7 巨噬细胞的自噬小体数量变化。

1.2.7 免疫荧光标记巨噬细胞LC3-II 表达 收集RAW264.7 巨噬细胞，4%甲醛固定，加LC3-II 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶200）室温孵育2 h。荧光显微镜下观察RAW264.7 巨噬细胞LC3-II 阳性表达。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS 20.0 分析数据，以±s）表示。用单因素方差one-way ANOVA 方差分析，方差齐时以LSD 法比较组间多重数据，方差不齐时以Dunnett’s T3 法比较组间多重数据，以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DXR 含药血清对巨噬细胞活力的影响

与空白对照组比较，LCN2 可显著降低RAW264.7 巨噬细胞活力（P<0.01）；与LCN2 组比较，DXR 含药血清可显著减轻由LCN2 诱导的巨噬细胞活力的下降（P<0.05）；与DXR 含药血清组比较，LY294002 及Triciribine 可进一步减轻巨噬细胞活力的下降（P<0.05）。见表1。

表1 各组RAW264.7巨噬细胞活力的测定结果，n=3） %

表1 各组RAW264.7巨噬细胞活力的测定结果，n=3） %

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与LCN2组比较，#P<0.05；与DXR含药血清组比较，▲P<0.05。

2.2 DXR 含药血清对巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平的影响

与空白对照组比较，LCN2 可显著增加RAW264.7 巨噬细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平（P<0.01）；与LCN2 组比较，DXR 含药血清可显著降低巨噬细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平（P<0.01）；与DXR 含药血清组比较，LY294002 及Triciribine 可进一步降低巨噬细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平（P<0.05）。见表2。

表2 各组RAW264.7巨噬细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平的测定结果s，n=3）

表2 各组RAW264.7巨噬细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平的测定结果s，n=3）

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与LCN2组比较，##P<0.01；与DXR含药血清组比较，▲P<0.05。

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2.3 DXR 含药血清对巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表达的影响

与空白对照组比较，LCN2 可显著增加RAW264.7巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表达（P<0.05）；与LCN2 组比较，DXR 含药血清可显著降低巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表达（P<0.05）；与DXR 含药血清组比较，LY294002 及Triciribine 可进一步降低巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表达（P<0.05） 。见图1。

图1 各组RAW264.7巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达的测定结果

2.4 DXR 含药血清对巨噬细胞自噬小体数量的影响

与空白对照组比较，LCN2 可显著减少RAW264.7 巨噬细胞自噬小体数量（P<0.05）；与LCN2 组比较，DXR 含药血清可显著增加巨噬细胞自噬小体数量（P<0.05）；与DXR 含药血清组比较，LY294002 及Triciribine 可进一步增加巨噬细胞自噬小体数量（P<0.05） 。见图2。

图2 各组RAW264.7巨噬细胞自噬小体数量的测定结果

2.5 DXR 含药血清对巨噬细胞LC3-II 表达的影响

与空白对照组比较，LCN2 可显著降低RAW264.7巨噬细胞LC3-II 表达（P<0.05）；与LCN2 组比较，DXR 含药血清可显著增加巨噬细胞LC3-II 表达（P<0.05）；与DXR 含药血清组比较，LY294002及Triciribine 可进一步增加巨噬细胞LC3-II 表达（P<0.05） 。见图3。

图3 各组RAW264.7巨噬细胞LC3-II表达的测定结果

3 讨论

LCN2 是由脂肪细胞分泌的与炎症密切相关的一种新型脂肪细胞因子，在炎症过程中，LCN2 可以通过结合白三烯B4 形成促炎介质［3-4］。LCN2 还能和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）结合形成复合物，防止MMP-9 被金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitors of metalloproteinases-1，TIMP-1）特 异 性下调表达，增加基质降解和纤维帽破裂［5］。本研究结果表明，与空白对照组比较，以10 μmol/L LCN2作 用RAW264.7 巨噬 细胞48 h 后，可 显 著 降 低RAW264.7 巨噬细胞活力，显著增加巨噬细胞培养液中炎症因子IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平，并显著增加巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表达。研究结果证实LCN2可显著诱导巨噬细胞炎症反应。

巨噬细胞自噬水平下降，机体游离胆固醇水平降低，载脂蛋白A1 运脂减少，外周血中高密度脂蛋白（high density lipoprotein，LDL）负反馈性下降，可降低脂质斑块稳定性，促进AS斑块破裂［6］。LC3-II 的含量反映了自噬体的数量，其含量和发生的自噬水平成正比，是目前最广泛用以检测自噬激活的分子标记物［7］。本研究结果表明，与空白对照组比较，以10 μmol/L 的LCN2 作用RAW264.7 巨噬细胞48 h 后，可显著减少RAW264.7巨噬细胞自噬小体数量，并显著降低巨噬细胞LC3-II 表达。研究结果证实LCN2 诱导巨噬细胞炎症反应的发生与巨噬细胞自噬水平的下降有关。

PI3K/Akt 信号通路在细胞自噬中发挥了关键调节作用，抑制PI3K/Akt 信号通路，可激活巨噬细胞自噬水平，减轻炎症反应，从而抑制AS 进展［8］。DXR 是由丹参、赤芍、苦参等10 余味药物组成的中医心血管疾病经验方，既往研究证实DXR 对AS 疗效确切。本研究结果表明，与LCN2 组比较，DXR 含药血清可显著减轻由LCN2 诱导RAW264.7巨噬细胞活力的下降，显著降低巨噬细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平及巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表达，显著增加巨噬细胞自噬小体数量及巨噬细胞LC3-II 表达。与DXR 含药血清组比较，LY294002 及Triciribine 可进一步加强DXR 含药血清对巨噬细胞的功效。研究结果证实，DXR 含药血清可显著减轻LCN2 诱导的巨噬细胞炎症反应，其机制与抑制PI3K/Akt 通路增加巨噬细胞自噬相关。本研究结果为DXR 防治AS 提供了一定的实验依据，其抗AS 分子机制尚需进一步深入研究。