分子标记辅助选择Pi9基因改良水稻不育系桃农1A稻瘟病抗性

李博文 雷权强 黄俊 张婷 邹玉莹 车凡昊 邓吉奇 刘金灵,2,3 刘雄伦,2,3*

（1 湖南农业大学农学院，长沙 410128；2 作物基因工程湖南省重点实验室，长沙 410128；3 水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室，长沙 410128；4 湖南农业大学教育学院，长沙410128；*通讯作者：xionglun@hunau.edu.cn）

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。由Magnaporthe oryzae 引起的稻瘟病是水稻生产中最严重的病害之一，在全球广泛发生，对水稻的产量和品质造成严重影响，其以叶瘟、穗颈瘟最为常见，严重时可导致水稻减产50%～80%，甚至颗粒无收[1]。实践表明，培育和推广抗稻瘟病水稻新品种[2-3]是防治稻瘟病最有效的方法之一。来源于小粒野生稻（Oryza minuta）的Pi9 基因是第1 个被成功克隆的广谱持久抗稻瘟病基因，对来源于不同国家的多数稻瘟菌生理小种（菌株）均具有抗性[4-7]。

分子标记辅助选择（Marker-assisted Selection，MAS）育种可定向改良目的性状，且不受外界环境影响，大大提高育种选择效率、缩短育种年限，是现代分子育种的重要手段[8]。75-1-127 是通过小粒野生稻与籼稻品系IR31917 远缘杂交再连续回交获得的高抗稻瘟病籼稻品系[9]。桃农1A 是湖南省桃源县农业科学研究所选育的优质籼型三系不育系，具有不育性好、遗传性状稳定、高柱头外露率、易制种、高配合力、米质优、抗倒能力强等优点，至今还一直在生产上广泛应用[10]。然而，桃农1A 的稻瘟病抗性较差，叶瘟与穗瘟均达到5 级[11]，使其推广应用受到严重限制，因此，改良桃农1A 的稻瘟病抗性将大大提高其应用价值。本研究利用75-1-127 作为Pi9 基因的供体亲本，先后以保持系桃农1B 及其不育系桃农1A 为受体亲本，利用基于Pi9基因内序列开发的共显性InDel 标记，通过MAS 连续回交育种定向改良桃农1B 与桃农1A 的稻瘟病抗性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻材料：高抗稻瘟病籼稻品系75-1-127（Pi9 基因供体亲本、抗病对照）；三系不育系桃农1A 及其保持系桃农1B（Pi9 基因受体亲本）；感病对照品系CO39。

稻瘟菌菌株：15 份来自国内外不同稻区的稻瘟菌菌株，用于室内接种抗菌谱分析。

1.2 试验方法

1.2.1 标记基因型分析

DNA 模板提取：用2 mL 灭菌离心管取候选水稻单株小分蘖叶片约0.2 g，加液氮研磨后用CTAB 法提取总DNA[12]。

PCR 体系（10 μL）：模板DNA 1.0 μL，5 U/μLTaq 酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O6.7 μL。PCR 热循环参数：94 ℃5 min；94 ℃30 s；55 ℃30 s；72 ℃30 s；30 cycles；72 ℃10 min。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR 产物，分析单株标记基因型。

1.2.2 分子标记辅助选择育种实践

自2015年夏季开始，用桃农1B 作母本及轮回亲本，75-1-127 作父本，连续多年在湖南长沙与海南三亚两地开展分子标记辅助选择回交育种实践，用CoInDF1R2标记在各回交群体中进行Pi9 基因前景选择，用田间主要农艺产量性状作为单株基因组背景选择，于2018年冬季在海南获得稳定、整齐、高抗稻瘟病的桃农1B-Pi9 的BC5F3代群体（株系）。同时，以桃农1A 为母本，从改良保持系桃农1B-Pi9 群体中选择高抗稻瘟病且农艺产量性状优良的株系作父本及轮回亲本，利用MAS 技术，于2020年冬季在海南获得改良不育系桃农1A-Pi9 的BC3F1代群体（株系）。2021年5—6月份在湖南浏阳大围山病圃经苗瘟抗性鉴定后，对改良抗病不育系桃农1A-Pi9 进行田间综合调查分析，最后遴选高抗稻瘟病且不育特性好、农艺产量性状表现优良的新不育系。

1.2.3 稻瘟病抗性鉴定与抗菌谱分析

田间病圃苗瘟抗性鉴定：试验于2019—2021年的5月中旬至6月中旬在湖南浏阳大围山稻瘟病天然病圃进行，具体参考廖花等人的方法[13]。

稻瘟菌室内人工接种：分别用15 份稻瘟菌菌株接种水稻第3 片完整叶片，接种孢子悬浮液浓度为1.5×105个/mL 左右。接种后调查苗瘟抗性表型、分析抗菌谱。接种方法为打孔接种法或喷雾接种法，其中打孔接种后于10～15 d 调查发病情况，喷雾接种后于7 d 后调查发病情况。

稻瘟病分级标准参照Bonman 的0～5 级标准[14]。

1.2.4 不育特性调查

调查桃农1A 与其改良系的不育特性，包括柱头外露率、包颈粒率、自交结实率、不育度、不育株率、花粉育性及其败育类型、不育花粉率，具体操作参考文献[15-17]。

柱头外露率与包颈粒率：待不育系抽穗扬花结束后，随机选取30 穗，调查总颖花数和柱头外露颖花数（包括柱头单边外露颖花数和柱头双边外露颖花数），计算柱头外露率；同时调查终花后的每穗抽出颖花数和包颈颖花数，计算包颈粒率。

自交结实率、不育度与不育株率：不育系于孕穗末期随机取10 株，用羊皮纸袋套袋，于20 d 后调查自交结实率、不育株率及不育度。

花粉育性及败育类型：不育系开花盛期，随机取10 个刚开始开花的稻穗进行镜检，在每个稻穗的上、中、下三个部位分别取即将开花的3 朵颖花，将其花药用干净的镊子夹出至盖玻片上并捣碎，用1% I2-KI 溶液染色，在光学显微镜下观察花粉育性及败育类型。

不育花粉率：镜检时取10 个干净清晰的视野，统计每个视野下的不育花粉率。

1.2.5 农艺产量性状调查

调查桃农1B、桃农1A 及其改良群体的播始历期、株高、剑叶长和剑叶宽、穗长、分蘖数、有效穗数、单穗颖花数、着粒密度、千粒重、结实率等主要农艺产量性状，方法见参考文献[18-19]。

每个水稻材料为1 个小区，每个小区7 行，每行7株，株距20 cm，行距25 cm，正常肥水管理，在分蘖期晒田以抑制无效分蘖生长。水稻分蘖末期，调查每个小区第3、4 行共14 株植株的分蘖数；在水稻始穗期调查每个材料的播始历期；待水稻成熟后，同样以每个小区第3、4 行共14 株作为样本，调查每株株高、剑叶长和剑叶宽、穗长、有效穗数、单穗颖花数、实粒数，计算每穗着粒密度与结实率；水稻种子收割后经晒干水分、室内脱粒后测量千粒重，3 次重复。

1.2.6 数据处理

使用Excel 2010、Statistix 8.0 与GraphPad Prism 8.3.0 软件进行数据处理与分析；采用最小显著性差异法（LSD）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 Pi9 基因多态分子标记筛选

用本实验室开发的Pi9 基因内分子标记对供体亲本75-1-127 与受体亲本桃农1B 和桃农1A 做基因型分析，筛选多态标记用于MAS 育种实践。获得供体/受体亲本间多态性稳定的共显性InDel 标记CoInDF1R2（Pi9 基因内元序列；正向引物：5'-ATCCACGAAACATCCACCATCC -3',反向引物 ：5' -TGAGCTAGCTCTTGCCTCCGAG-3'），该标记在75-1-127 基因组中扩增出1 条大小为354 bp 的稳定条带，而在桃农1B 或桃农1A 基因组中的PCR 产物大小约为470 bp，2 条扩增产物可以用琼脂糖凝胶电泳简便区分（图1）。

2.2 CoInDF1R2 辅助选择育成高抗稻瘟病不育系桃农1A-Pi9 及其保持系桃农1B-Pi9

利用共显性标记CoInDF1R2连续多年开展MAS 育种实践，2015年夏季至2018年冬季获得26 个改良保持系桃农1B-Pi9，从中遴选出3 个高抗稻瘟病、农艺产量性状较好的改良系作为父本与轮回亲本，继续与桃农1A 杂交并连续回交，于2020年冬季在海南三亚获得3 个对应改良不育系桃农1A-Pi9。标记基因型鉴定结果（图1）表明，改良不育系及其配套保持系的Pi9 基因位点均已纯合。

图1 桃农1A-Pi9、桃农1B-Pi9 标记基因型鉴定和人工接种表型1B-Pi9

2.3 亲本及改良株系病圃苗瘟抗性表型及抗菌谱

田间病圃苗瘟抗性鉴定结果表明，供体亲本75-1-127 苗瘟为0 级，表现为高度抗病；受体亲本桃农1B与桃农1A 苗瘟均达到4 级，表现为高度感病；3 份改良不育系桃农1A-Pi9（BC3F1群体）及其配套改良保持系桃农1B-Pi9（BC5F6群体）苗瘟抗性表型均为0 级，表现为高度抗病，且均未出现感病分离株；感病对照材料CO39 苗瘟为5 级，表现为高度感病。室内人工接种抗菌谱结果（表1）显示，75-1-127 对15 份稻瘟菌菌株中的13 份表现抗病，但对X2007A-7 和ROR1 表现感病，抗性频率为86.67%；CO39 对15 份菌株均表现感病，抗性频率为0；桃农1B 和桃农1A 均对X2007A-1表现抗病，而对其余14 份菌株表现感病，抗性频率为6.67%；改良不育系桃农1A-Pi9-1 及其保持系桃农1B-Pi9-1 的抗病表型与供体亲本75-1-127 一致，均对X2007A-7 和ROR1 表现感病，而对其余13 份菌株表现抗病，抗性频率均为86.67%。上述结果表明，Pi9基因抗性水平高、抗谱广，已被成功应用于改良桃农1B 和桃农1A 的稻瘟病抗性。

表1 亲本及改良材料对15 份供试稻瘟菌菌株的抗菌谱

2.4 桃农1A-Pi9 不育特性

受体亲本桃农1A 与3 个改良抗病不育系桃农1A-Pi9 的柱头肥大且均为黑色。调查结果（图2）表明，3 个改良不育系的柱头总外露率均有提高，其中桃农1A-Pi9-1 柱头外露率最高（74.82%）且显著高于桃农1A（62.79%），异交习性获得改良。自然状态下桃农1A包颈严重，桃农1A-Pi9-1 和桃农1A-Pi9-3 的包颈粒率（分别为29.92%、24.48%）均低于桃农1A（33.97%），而桃农1A-Pi9-2 包颈粒率（48.21%）显著高于桃农1A。经田间调查统计，桃农1A 与3 个改良不育系的自交结实率均为0，不育株率与不育度均为100%，不育性彻底且稳定。花粉镜检结果显示，桃农1A 与3 个改良不育系的花粉败育率均为100%，圆败花粉和典败花粉率各约50%。可见，改良不育系桃农1A-Pi9-1 和桃农1A-Pi9-3 不育性彻底且稳定，柱头外露率高，包颈粒率低，不育特性进一步提升。

图2 不育系主要不育特性

2.5 桃农1B-Pi9 与桃农1A-Pi9 主要农艺产量性状

3 个改良保持系的播始历期为72～73 d，比桃农1B长1～2 d；3 个改良不育系的播始历期为74～75 d，比桃农1A 长1～2 d。与2 个受体亲本一样，3 个改良不育系及其保持系株型紧凑，叶片上举，抗倒伏性好。调查结果（表2、表3）表明，桃农1B-Pi9-1 株高最低，但仍显著高于桃农1B；桃农1A-Pi9-1 在3 个改良不育系中最矮，略高于桃农1A。3 个改良不育系分蘖力、单穗颖花数相对于桃农1A 均有所提高；3 个改良保持系单穗颖花数、着粒密度、千粒重和结实率相对于桃农1B 也均有提高。可见，3 个改良不育系及其保持系的不同性状表现各有优劣，但桃农1A-Pi9-1 的株高明显低于其他2 个改良不育系，且其柱头外露率在3 个改良系中最高，包颈粒率也比较低。综合农艺产量性状与不育特性，桃农1A-Pi9-1 是今后生产上应用的首选。

表2 不育系与保持系主要农艺性状

表3 不育系与保持系主要产量结构

3 讨论

水稻稻瘟病抗性是典型的质量-数量性状，不仅受到单个或主效R 基因的控制，还与多种环境因素尤其是与病原菌的互作有着密切联系[20-22]。稻瘟病抗性育种中，仅通过田间表型选择的常规育种方法效率低，且不利于开展多基因聚合育种，选育出来的新品种很难实现广谱持久抗性[23]。MAS 育种是对标记基因型的直接鉴定和选择，不受外界环境因素影响，大大提高了选择准确性与效率，是现代分子育种的主要方式[24]。MAS 育种改良稻瘟病抗性已有较多报道，如R153 的选育[25]、龙黑198 的选育[26]、M630 的改良[27]等。本实验室10 多年来通过MAS 技术改良了一批水稻品系的稻瘟病抗性，包括常规稻如湘晚籼13 号[28]、恢复系如R747[13]、三系不育系如丰源A[29]。

本研究利用基于Pi9 基因内元序列开发的共显性InDel 标记CoInDF1R2，连续多年开展MAS 回交育种实践，最后育成了高抗稻瘟病且综合性状优良的三系不育系桃农1A-Pi9-1 及其配套保持系桃农1B-Pi9-1，为三系杂交水稻育种创制了新的亲本材料。在此基础上，我们将继续开展以下工作：使用更多不同稻区的稻瘟菌小种（菌株）接种，进一步明确受体亲本与改良系的抗菌谱；将改良系引入不同生态稻区做苗瘟和穗瘟抗性鉴定，明确桃农1A-Pi9-1 及其杂交种的适宜种植区；用桃农1A-Pi9-1 广泛配组，选配广谱高抗稻瘟病、优质、高产、广适的强优势杂交组合F1代应用于生产，同时分析桃农1A-Pi9-1 的恢复源相对于桃农1A 是否发生改变。

本研究中我们注意到，桃农1A 刚育成时花粉败育类型主要为典败型，典败率达99.86%[11]，与实验室往年镜检结果相符。然而，2021年桃农1A 圆败花粉比例大大增加，达50%左右，出现这种现象很可能是由于2021年开花期持续高温所致，前人有过相关报道[30]。