抑制HDAC11减轻OGD/R所致的HT22细胞损伤*

郑琪雪 ， 杨 洋 ， 费慧芝 ， 杨俊卿 △

（1重庆医科大学，重庆 400016；2重庆医科大学附属妇女儿童医院，重庆 400021；3重庆市妇幼保健院，重庆 400021）

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage， HIBD）是由围产期胎儿因缺乏血流或气体交换障碍导致［1］。新生儿的大脑需要高水平的氧气供应，因此对缺氧极为敏感。严重的HIBD导致诸多神经系统后遗症，包括智力迟钝，认知障碍，脑瘫和癫痫等［2］。目前，临床上主要采用亚低温治疗、对症治疗和营养支持等方法。HIBD的病理生理机制并不完全清楚，临床治疗效果并不理想，因此需深入探究其发展机制，寻找HIBD干预新靶点。

组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylases， HDACs）包含4类，家族成员众多，发挥的功能作用并不相同。抑制Ⅰ类HDACs改善APP/PS1转基因小鼠的β-淀粉样蛋白沉积［3］；抑制Ⅱ类HDACs调节组蛋白H2A及α-微管蛋白乙酰化水平改善脑缺血大鼠神经元损伤［4-5］；与Ⅰ类和Ⅱ类作用不同，Ⅲ类HDACs可能有神经保护作用，抑制Sirt1（Ⅲ类）会加重小鼠脑缺血损伤，其机制与P5及P65乙酰化水平增加有关［6-7］；HDAC11属于第Ⅳ类中唯一的成员，在脑内表达丰富，影响小鼠脑内神经细胞的发育，HDAC11是一种涉及多种细胞途径的酶，但关于所涉及的分子机制仍不清晰［8］，且HDAC11在不同环境中的调节作用呈现差异性。虽有研究表明［9］，抑制HDAC11促进抗炎因子白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）的表达，但另有研究显示，敲除HDAC11基因会增加嗜中性粒细胞促炎因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha， TNF-α）及IL-6的表达［10］。HDAC11在中枢神经系统疾病的作用研究尚少，HDAC11在HIBD中是否发挥作用，是保护作用还是损伤性作用，其作用机制如何，这些均不清楚，值得研究。

氧化应激是氧化剂与抗氧化剂平衡的紊乱。由于新生儿的特性，更容易受到氧化应激损伤。新生儿大脑富含脂肪酸，容易受到自由基和脂质过氧化损伤，未成熟脑组织对自由基高度敏感且抗氧化功能不完善［11］。氧化应激是HIBD发生后神经元死亡的重要原因。HIBD发生后，细胞内Ca2+、Na+和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate， ADP）升高导致线粒体产生有害活性氧，导致多不饱和脂肪酸氧化成丙二醛（malondialdehyde，MDA），同时活性氧介导分子信号传导，其中转录因子p53激活产生促凋亡蛋白如BAX，促进坏死和细胞凋亡［12］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）及还原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）保护细胞免受自由基的侵害，内源性抗氧化物GSH的含量的增加减轻神经损伤［13］。MDA，SOD，GSH是氧化应激的标志性物质。

小鼠HT22细胞氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）能够部分模拟HIBD的病理生理过程变化［14］，因此本研究旨在观察N'-十六烷基噻吩-2-碳酰肼（N'-hexadecylthiophene-2-carbohydrazide， SIS17）特异性抑制 HDAC11对OGD/R致小鼠HT22细胞损伤的作用，并从酪氨酸激酶（Mer tyrosine kinase， MerTK）调控氧化应激损伤和凋亡通路初步探讨其机制。

材料和方法

1 细胞

小鼠海马区神经元HT22细胞系购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

2 主要试剂

DMEM高糖培养液、DMEM无糖培养液及0.25%胰蛋白酶购自Gibco；青霉素-链霉素溶液（C0222）购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自苏州依科赛生物科技有限公司；HDAC11特异性抑制剂SIS17（HY-128918）购自MedChemExpress；LDH（A020-2），SOD（A001-3），GSH（A006-2-1）和MDA（A003-1）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司；细胞凋亡检测试剂盒（MA0220）购自大连美仑生物技术有限公司；抗β-Tubulin抗体（10068-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；抗HDAC11抗体（bs-2894R）及抗 caspase12抗体（bs-23014R）购自北京博奥森生物技术有限公司； 抗MerTK抗体（DF7344），抗ATF6抗体（DF6009）及抗Bax抗体（AF0120）均购自Affinity；HRP标记山羊抗兔IgG购自北京兰杰柯科技有限公司。

3 实验仪器

细胞培养箱（311，Thermo Scientific）；三气培养箱（3423，Thermo Scientific）；低温离心机（Icen-24R，Thermo Scientific）；垂直电泳仪（041BR304570，BIORAD）；成像仪（VLBL00D2， BIO-RAD）。

4 实验方法

4.1 细胞培养 完全培养液：10%胎牛血清，1%青霉素链霉素溶液，89%DMEM高糖培养液。细胞传代：HT22细胞于37 ℃培养箱中培养，密度达到85%时进行传代，弃置原完全培养液，PBS润洗2次后加入0.25%胰蛋白酶于培养箱中消化1 min，添加适量完全培养液终止消化，吹打细胞成均一悬液，1 000 ×g离心4 min，取新配置完全培养液重悬细胞，接种至新的培养瓶中。

4.2 OGD/R模型建立及实验分组 培养HT22细胞至85%密度时，除对照（control）组，其他各组弃去培养液后用PBS润洗2次，添加工作体积DMEM无糖培养液并置于三气培养箱（95% N2，1%O2，4% CO2）中进行氧糖剥夺4 h，再更换为DMEM高糖完全培养液于普通培养箱复糖复氧24 h。根据本实验对HDAC11特异性抑制剂SIS17安全范围筛查以及文献报道SIS17具有剂量依赖性［15］，本研究对SIS17剂量 的 设 置 为（SIS17-L：3×10-6mol/L，SIS17-M：1×10-5mol/L，SIS17-H：3×10-5mol/L）。本次研究中细胞实验分为5组：对照（control）组，模型（OGD/R）组，OGD/R+L组，OGD/R+M组和OGD/R+H组。

4.3 MTT法检测细胞活力 HT22细胞以每孔3 000个接种于96孔板，高中低剂量SIS17处理24 h后进行OGD/R，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），37 ℃孵育4 h，低速离心，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓒，于水平摇床避光震荡15 min充分溶解，酶标仪490 nm处测定吸光度（A）值，根据公式计算细胞活力，细胞活力（%）=［A值（实验组）-A值（空白组）］/［A值（对照组）-A值（空白组）］×100%，实验组：OGD/R，OGD/R+L，OGD/R+M，OGD/R+H；对照组：control；空白组：含完全培养液无细胞。

4.4 细胞LDH测定 收集各组细胞培养液，依次加入双蒸水，0.2 mol/L丙酮酸标准液，待测样本，基质缓冲液，辅酶I，混匀。37 ℃温浴15 min，加入2，4-二硝基苯肼，混匀，37 ℃温浴15 min，加入0.4 mol/L NaOH溶液混匀，室温放置5 min，波长450 nm，酶标仪测定吸光度值。

4.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 将HT22细胞用不含EDTA的胰酶消化，1 000 ×g离心5 min，收集细胞，加入预冷PBS溶液洗涤离心2次，在细胞沉淀中加入结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin VFITC和10 μL碘化丙碇（PI）染色液并混匀，室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

4.6 TUNEL染色 用PBS润洗HT22细胞，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS润洗，0.3% Triton X-100室温反应30 min，PBS润洗，加入平衡缓冲液，室温反应40 min，倒掉液体加入缓冲液，37 ℃孵育1.5 h，PBS润洗后，加入DAPI溶液复染10 min，PBS润洗后，荧光显微镜下成像。200倍下选择4个具有代表性的视野，计数阳性细胞数和阴性细胞数，阳性细胞百分率%=阳性细胞总数/（阳性细胞总数+阴性细胞总数）×100%，取平均值。

4.7 SOD，GSH和MDA测定 收集各组细胞培养液，根据试剂盒说明书，参考文献方法［16］，于孔板加入相应试剂，分别于450 nm和405 nm处测定SOD及GSH吸光度值。TBA法测定MDA，PBS润洗并收集细胞，破碎细胞后根据试剂盒步骤操作，于532 nm处测定MDA吸光度值。

4.8 Western blot检测蛋白表达水平 收集细胞总蛋白，加入蛋白裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶2）经破碎后低温离心（4 ℃，12 000 ×g）15 min，取上清测蛋白浓度，按1∶4的比例加入5×蛋白上样缓冲液，98℃变性15 min，取30 μg进行上样。蛋白经电泳（90V，30 min；120 V，60 min）转膜（250 mA，100 min）后经5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育Ⅰ抗4 ℃过夜，TBST洗3次每次5min，室温孵育Ⅱ抗（1∶2 000），TBST洗3次，ECL发光液用于成像。抗体稀释倍数：兔多克隆抗体：HDAC11（1∶1 000），MerTK（1∶1 000），Bax（1∶1 000），caspase-12（1∶1 000）和 β-Tubulin（1∶1 000），HRP 标记山羊抗兔 IgG（1∶4 000），Image Lab对图像进行灰度值分析。

5 统计学处理

使用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析。计量数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05具备统计学差异。

结 果

1 HDAC11特异性抑制剂SIS17在HT22细胞上的安全范围

MTT法筛选HDAC11特异性抑制剂SIS17的安全范围。在10-4～10-13mol/L范围内，SIS17对HT22细胞活力的影响不显著（P＞0.05），见图1A。OGD/R处理HT22细胞后，细胞数量减少，呈现损伤状态；不同浓度SIS17处理OGD/R细胞后，细胞数量增加，细胞状态得到改善，见图1B。

Figure 1. Effect of HDAC11 inhibitor on viability and morphological of HT22 cells treated with OGD/R. A： cell viability detected by MTT assay； B： morphological alterations of HT22 cells. Mean±SEM. n=4.图1 抑制HDAC11对小鼠HT22细胞活力及形态学的影响

2 抑制HDAC11对OGD/R处理小鼠HT22细胞的存活率及LDH影响

MTT实验结果显示，相比于control组，OGD/R组小鼠HT22细胞的活力显著降低（P＜0.05）；相比于OGD/R组，OGD/R+L组细胞活力有上升趋势但无显著性差异（P＞0.05），OGD/R+M及OGD/R+H组细胞活力显著升高（P＜0.05），见图2A。如图2B所示，相比于control组，OGD/R组HT22细胞LDH活力显著升高（P＜0.01）；相比于 OGD/R 组，OGD/R+L组，OGD/R+M组及OGD/R+H组HT22细胞LDH活力均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Figure 2. Effect of inhibiting HDAC11 on viability and LDH of HT22 cells treated with OGD/R. A： cell viability； B： LDH activity of HT22 cells； Mean±SEM. n=4. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs OGD/R group.图2 抑制HDAC11对小鼠HT22细胞活力及LDH活力的影响

3 抑制HDAC11对OGD/R处理的HT22细胞凋亡的影响

为探究HDAC11特异性抑制剂SIS17对OGD/R处理小鼠HT22细胞凋亡的影响，流式细胞术结果显示，相比于control组（凋亡率6.71%），OGD/R组细胞凋亡率升高（凋亡率37.14%），相比于OGD/R组，OGD/R+L，OGD/R+M及OGD/R+H组细胞凋亡率降低（分别为：26.69%，16.64%，15.78%）（P＜0.05，P＜0.01，见图3A）。如图3B，TUNEL染色结果显示，相比于control组，OGD/R组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；相比于OGD/R组，OGD/R+H组细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。

4 抑制HDAC11减轻OGD/R处理的HT22细胞氧化应激损伤

Figure 3. Inhibition of HDAC11 ameliorate apoptosis of HT22 cells damaged by OGD/R. A： the apoptosis rate of HT22 cells was detected by flow cytometry； B： TUNEL staining， blue DAPI， red TUNEL （scale bar=100 μm）. Mean±SEM. n=3. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.图3 抑制HDAC11改善小鼠HT22细胞凋亡

为探究HDAC11特异性抑制剂SIS17对OGD/R致小鼠HT22细胞氧化应激的影响。如图4所示，相比于control组，OGD/R组超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽（GSH）含量显著降低（P＜0.01，P＜0.05），丙二醛（MDA）显著升高（P＜0.01），细胞氧化应激损伤明显。相比于OGD/R组，OGD/R+L组和OGD/R+M组细胞的SOD及GSH含量有上升趋势，MDA有降低趋势但无统计学（P＞0.05）；相比于OGD/R组，OGD/R+H组SOD及GSH含量显著升高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）。

Figure 4. Inhibition ofHDAC11 ameliorate oxidative stress injury in HT22 cells damaged by OGD/R.A： SOD level； B： GSH level；C： MDA level. Mean±SEM. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.图4 抑制HDAC11改善小鼠HT22细胞氧化应激损伤

5 抑制HDAC11对OGD/R处理的小鼠HT22细胞蛋白表达的影响

如图5所示，相比于control组，OGD/R组HDAC11，MerTK，caspase-12及Bax蛋白表达显著上调（P＜0.05，P＜0.01）。相较于OGD/R组，OGD/R+L组及OGD/R+M 组Bax表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），而HDAC11，MerTK和caspase-12蛋白表达水平 均 无 显 著 性 差 异（P＞0.05）；OGD/R+H 组HDAC11，caspase-12及 Bax显著降低（P＜0.05，P＜0.01），而MerTK蛋白表达显著上调（P＜0.05）。

讨 论

Figure 5. Effect of HDAC11 inhibitor on protein expression of HDAC11， MerTK， caspase12， BAX in OGD/R treated with HT22 cells. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs OGD/R group.图5 抑制HDAC11对小鼠HT22细胞蛋白表达的影响

新生儿缺氧缺血性脑损伤是（HIBD）导致死亡和终身残疾的主要原因，急需寻求新的治疗靶点。小鼠HT22细胞是一种原代小鼠海马神经元培养物中永生化的亲本HT4细胞的亚系，可以很好的体外模拟神经元功能。HDACs抑制剂多为非选择性抑制多个HDAC，不能针对性抑制特定的靶标。而SIS17是一种靶向性HDAC11抑制剂，并不影响其他HDACs的活性及表达量［14］。本研究在小鼠HT22细胞上模拟HIBD疾病模型，并初步探讨抑制HDAC11对HIBD的作用及机制。

研究表明，HIBD的发生导致神经递质释放异常，小胶质细胞受到刺激产生大量氧自由基，这些物质通过氧化还原信号破坏血脑屏障完整性，启动细胞凋亡，凋亡的细胞得不到及时清除会释放细胞因子引起更强的级联反应，从而导致神经元的进一步损伤［17-18］。新生儿因自身特性，更易受到凋亡及氧化应激损伤，MerTK通路可抑制先天免疫反应并促进凋亡细胞的清除，缓解神经元的进一步损伤，因此针对MerTK调控凋亡及氧化应激通路或可改善HIBD。本次实验研究中，我们显示OGD/R致小鼠HT22细胞活力显著降低，LDH漏出及细胞凋亡率明显增加的同时，HDAC11及MerTK表达升高，凋亡蛋白caspase-12和Bax显著上调。HDAC11特异性抑制能明显增强细胞活力、降低细胞凋亡率，显著下调caspase-12及Bax，而进一步上调MerTK表达。有报道，HIBD发生后，小胶质细胞通过TREM2上调吞噬功能介导突触丢失，但适当的吞噬作用有利于维持稳态［19］。已有研究表明，局灶性脑缺血后，小胶质细胞MerTK瞬时上调促进凋亡细胞的清除维持脑内稳态，而敲除MerTK导致凋亡碎片累积加重细胞损伤［20］。结合这些实验结果，我们认为，OGD/R致小鼠HT22细胞MerTK表达增加是一种保护性机制，而特异性抑制HDAC11可明显改善OGD/R致小鼠HT22细胞损伤，其机制可能通过进一步上调MerTK，促进凋亡细胞的清除，减轻凋亡细胞释放细胞因子引发更激烈的级联反应。

HIBD发生时，细胞内的活性自由基氧化生物分子破坏细胞脂质、蛋白质和核酸，并在HIBD发生后启动相关信号通路，导致细胞死亡和组织损伤［21］。MDA是脂质过氧化的终产物之一，SOD和GSH具有协同抗氧化作用。有研究表明MerTK通路的激活能促进小鼠原代巨噬细胞在氧化应激损伤中存活［22］。敲除HDAC11基因调控HO-1及Nrf-2改善果糖诱导的小鼠心肌细胞凋亡，减少活性氧产生，改善氧化应激损伤［23］。本次实验研究中，我们还发现，OGD/R致小鼠HT22细胞损伤、HDAC11及MerTK表达上调的同时，细胞MDA含量显著升高，SOD及GSH显著降低；抑制HDAC11显著降低OGD/R处理小鼠HT22细胞MDA含量，显著升高SOD及GSH水平。综合我们的实验结果及文献报道，抑制HDAC11明显改善OGD/R致小鼠HT22细胞损伤的机制，可能还涉及通过进一步升高MerTK水平，进而减轻氧化应激损伤。

总之，本实验研究表明，HDAC11上调MerTK表达，进而抑制细胞凋亡和氧化应激反应，参与OGD/R致小鼠HT22细胞损伤。但是需要进一步的体内外实验加以深入阐明，并明确HDAC11对MerTK是直接或间接调控的作用。